Epidemiologische Rolle des neuen und bereits bekannten „Ca. P. solani‘ cixiid-Vektoren bei der Gummipfahlwurzelkrankheit von Zuckerrüben in Serbien

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1433 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Gummipfahlwurzelkrankheit (RTD) von Zuckerrüben wurde kürzlich mit dem pflanzenpathogenen Bakterium „Candidatus Phytoplasma solani“ (CaPsol) in Verbindung gebracht und in der gesamten Pannonischen Tiefebene mit unterschiedlichem Schweregrad gemeldet. Die Verfolgung der epidemiologischen Pfade von CaPsol wurde in den Jahren 2020–2021 auf dem experimentellen Zuckerrübenfeld in Rimski Šančevi (Serbien) durchgeführt, wo kürzlich ein RTD-Ausbruch registriert wurde. Bei der Untersuchung von drei FTE-Auftretensszenarien wurde ein molekularepidemiologischer Ansatz angewendet: epidemisch, nicht epidemisch und „Fehlen von FTE“. Als Ergebnis wurde Hyalesthes obsoletus ex Convolvulus arvensis als CaPsol-Überträger für Zuckerrüben nachgewiesen, während zwei weitere Cixiiden erstmals als Überträger der CaPsol-induzierten Pflanzenkrankheit in Nutzpflanzen identifiziert wurden: Reptalus quinquecostatus und R. cuspidatus. R. quinquecostatus wurde für den Ausbruch der RTD-Epidemie im Jahr 2020 in Rimski Šančevi verantwortlich gemacht, als der dSTOLg-CaPsol-Stamm in den von RTD betroffenen Zuckerrüben vorherrschte, wohingegen R. cuspidatus eine vernachlässigbare Rolle beim Auftreten von RTD spielte und in größerem Maßstab eine unklare Beteiligung an der CaPsol-Epidemiologie zeigte . Die zeitliche Diskrepanz zwischen der Verbreitung von CaPsol und dem Auftreten von Krankheiten ist das Haupthindernis bei der Vorhersage von CaPsol-induzierten Krankheiten. Das Auftreten und die Schwere von Krankheiten können nur durch ein besseres Verständnis der epidemiologischen Signalwege von CaPsol und der an Krankheitsausbrüchen beteiligten Insektenvektoren vorhergesagt werden.

„Candidatus Phytoplasma solani“ (CaPsol) ist ein phytopathogenes Bakterium, das zahlreiche Kulturpflanzen in ganz Europa befällt1,2. Die Rubbery Taproot Disease (RTD) von Zuckerrüben ist die zuletzt beschriebene durch CaPsol verursachte Krankheit, deren Ätiologie bei einem Krankheitsausbruch 2018/2019 in Rimski Šančevi (Serbien) aufgedeckt wurde3. Das von RTD betroffene Zuckerrübenanbaugebiet in Serbien liegt im Norden des Landes, wo der überwiegende Teil dieser Kulturpflanze angebaut wird (97 %). Es umfasst − 50.000 ha mit einer durchschnittlichen Produktion von 2,5 Tonnen pro Jahr (FAOSTAT) 4. Typische RTD Symptome sind gummiartige Pfahlwurzeln sowie Gelbfärbung, Welke und Nekrose der Blätter3,4. RTD führt zu erheblichen Ertragsverlusten und Schwierigkeiten bei der industriellen Weiterverarbeitung der gummiartigen Pfahlwurzeln. Darüber hinaus sind betroffene Pfahlwurzeln anfällig für Fäulnis durch sekundäre und opportunistische Pilzpathogene, entweder auf Feldern oder in Pfahlpflanzen. Eine im Jahr 2020 durchgeführte FTE-Umfrage in der gesamten Pannonischen Tiefebene zeigte Unterschiede in der Schwere der Krankheit, von einem fast unbemerkten Auftreten in Österreich bis hin zu Epidemien in Serbien und der Slowakei4. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Fläche der Zuckerrübenproduktion in Europa, die für CaPsol anfällig ist, deutlich größer ist als die zuvor gemeldete Beschränkung auf Frankreich4,5.

Die Epidemiologie von CaPsol-induzierten Pflanzenkrankheiten hängt weitgehend von den Ernährungspräferenzen von Insektenvektoren ab, die sich von Phloemsaft ernähren, bei denen es sich in erster Linie um Zikaden der Familie Cixiidae (Hemiptera, Auchenorrhyncha) handelt6. Der effizienteste CaPsol-Überträger ist die weit verbreitete Zwergzikadenhyalesthes obsoletus Signoret, die mit CaPsol-Ausbrüchen in mehreren Nachtschattengewächsen und Weinreben in Verbindung gebracht wird7,8,9,10,11,12. Reptalus panzeri (Löw) ist ein weiterer CaPsol-Vektor, der ursprünglich mit der Maisrötung/Maisrötungskrankheit in Serbien in Verbindung gebracht wurde, seine Vektorrolle wurde jedoch später auf andere Nutzpflanzen ausgeweitet10,13,14. Seine kongenerische Art, R. quinquecostatus (Dufour) sensu Holzinger et al.15, wurde experimentell als CaPsol-Transmitter für Immergrün, nicht jedoch für Nutzpflanzen bestätigt16. Ein Cixiid von besonderem Interesse im Zusammenhang mit der Zuckerrüben-RTD ist Pentastiridius leporinus (Linné), der einzige bekannte Vektor von CaPsol und „Candidatus Arsenophonus phytopathogenicus“ auf Zuckerrüben, wobei letzterer mit dem Krankheitssyndrom „Basses Richesses“ assoziiert ist ( SBR) in Frankreich und Deutschland5,17,18,19.

Vektoren verbreiten CaPsol aus natürlichen Reservoirs – Unkräutern und Wildpflanzen – von denen einige von Insekten als Wirte genutzt werden können6,20. Die traditionelle epidemiologische Divergenz von CaPsol-Stämmen, die auf dem House-keeping-tuf-Gen (kodierender Faktor tu) basiert, wurde ursprünglich auf Wirtspflanzenpräferenzen des Vektors H. obsoletus zurückgeführt21. Urtica dioica L. beherbergt H. obsoletus-Populationen und lagert CaPsol-Stämme der Tuf-a- und Tuf-b2-Genotypen (tuf-ab) aus, die zur Tuf-a-Epidemiologie gehören21,22,23. Populationen von H. obsoletus, die mit Convolvulus arvensis L., Crepis foetida L. und Vitex agnus-castus L. assoziiert sind, verbreiten CaPsol-Stämme des Tuf-b-Typs in Mittel- und Südeuropa12,21,23,24. Es wurde außerdem festgestellt, dass der Tuf-b1-Genotyp dem Referenz-CaPsol-STOL-Stamm des Tuf-b-Typs entspricht1,22, während drei neue Typen/Genotypen, tuf-b3, b5 und b6, zusätzlich beschrieben wurden25,26. Die molekulare Typisierung von CaPsol-Stämmen, die an der RTD von Zuckerrüben beteiligt sind, ergab eine weitere neue Tuf-Sequenzvariante, tuf-d, die einen SNP-Unterschied im Vergleich zu tuf-b13 aufweist.

Der CaPsol-Multilocus-Genotyp dSTOLg (tuf-d/STOL/V2-TA), der zuvor in fast allen von RTD betroffenen Zuckerrübenfeldern in der gesamten Pannonischen Tiefebene gefunden wurde, überwiegte an Orten mit epidemischem RTD-Schweregrad4. Ziel dieser Studie war es daher herauszufinden, ob kulturspezifische CaPsol-Epidemiezyklen an der RTD von Zuckerrüben in Serbien beteiligt sind und ob diese neuen oder zuvor bekannten Übertragungswege mit unterschiedlichen RTD-Schweregraden verbunden sein können. Die Verfolgung der CaPsol-Wege durch verschiedene Wirte wurde durch einen molekularepidemiologischen Ansatz erreicht, der auf drei Genen basiert: tuf, stamp (kodiert für ein antigenes Membranprotein) und vmp1 (kodiert für ein variables Membranprotein), die jeweils eine Zugehörigkeit zu tuf-a oder tuf-b ausdrücken epidemiologische Zyklen22,23,24,27,28.

Die epidemiologische RTD-Studie wurde in den Jahren 2020 und 2021 auf dem experimentellen Zuckerrübenfeld des Instituts für Feld- und Gemüsepflanzen in Rimski Šančevi durchgeführt, wo CaPsol ursprünglich mit RTD in Verbindung gebracht wurde, und im Jahr 2019 wurde ein epidemisches Auftreten von Krankheiten registriert3,4. Auf zwei Zuckerrübenflächen wurden drei verschiedene RTD-Schweregradszenarien bewertet: (1) Epidemie; (2) keine Epidemie und (3) „Fehlen von FTE“. Alle wichtigen Punkte der CaPsol-Epidemiologie wurden untersucht: potenzielle Vektoren, vorläufige Reservoirpflanzen und Zuckerrüben im Feld. Darüber hinaus wurden CaPsol-Übertragungsversuche über drei mutmaßliche Cixiid-Vektoren durchgeführt, die in situ gefunden wurden: R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15, H. obsoletus ex C. arvensis (Ca) und Reptalus cuspidatus (Fieber). Darüber hinaus ist die Anwesenheit von 'Ca. A. phytopathogenicus, der Erreger von SBR, wurde in allen im Feld gesammelten Zuckerrüben untersucht.

Zwei Zuckerrübenparzellen im experimentellen Zuckerrübenfeld in Rimski Šančevi, die als Parzelle 1 und Parzelle 2 bezeichnet werden, wurden hinsichtlich des Auftretens und der Schwere von RTD in zwei Jahren, 2020 und 2021, bewertet. Die Schwere der epidemischen RTD wurde in der Parzelle bewertet. 1 im Jahr 2020 mit einer Krankheitsinzidenz von 10,3 %4. Obwohl symptomatische Pflanzen über die gesamte Parzelle verstreut waren, wurde im Nordosten (NO) der Parzelle, wo der angrenzende Grenzstreifen zu Beginn der Saison eine dichte Unkrautfläche beherbergte, eine deutliche Ansammlung der Zuckerrüben beobachtet, die stark von RTD betroffen waren (Abb. S1). ). Im Jahr 2021 wurde der RTD-Schweregrad in Parzelle 1 als nicht epidemisch mit einer Inzidenz von 0,1 % bewertet, wobei RTD-symptomatische Zuckerrüben nur verstreut in der Parzelle gefunden wurden. Weder im Jahr 2020 noch im Jahr 2021 wurden in der Zuckerrübenparzelle 2 RTD-Symptome beobachtet. Typische SBR-Symptome (z. B. Verfärbung des Wurzelgefäßgewebes) wurden in keiner der beiden Zuckerrübenparzellen beobachtet.

Insgesamt 50 aus Parzelle 1 entnommene Zuckerrüben mit RTD-Symptomen (25 pro Jahr) waren alle mit CaPsol infiziert. Dreißig asymptomatische Zuckerrüben, die auf Parzelle 2 gesammelt wurden (15 pro Jahr), waren alle CaPsol-negativ, was bestätigte, dass diese Parzelle in beiden Jahren RTD-frei war. Alle 80 im Feld gesammelten Zuckerrüben, RTD-symptomatisch und asymptomatisch, waren im 'Ca' negativ. A. phytopathogenicus' TaqMan qPCR-Assay, während der 'Ca. Die Positivkontrolle HN1220/5 von A. phytopathogenicus zeigte eine starke Amplifikation mit Cq-Werten < 32. Alle analysierten Proben sowie die Positivkontrolle zeigten im qPCR-Assay für Pflanzen (Zuckerrüben) ebenfalls eine hohe Amplifikation mit Cq-Werten < 25, was einen hohen Wert bestätigt Inhalt und Qualität der extrahierten DNA.

Im Jahr 2020 waren in Parzelle 1 insgesamt 10 Unkrautarten vorhanden (Tabelle 1). Nur C. arvensis durchdrang die gesamte Zuckerrübenparzelle und die umliegenden Grenzstreifen, während die anderen Unkräuter auf dem nordöstlichen Grenzstreifen aggregierten. In diesem Bereich sind Unkräuter über den Kulturrand gewachsen und haben sich räumlich mit der oben beschriebenen Ansammlung von Zuckerrüben mit RTD-Symptomen überlagert. Bei der Probenahme waren alle Unkräuter asymptomatisch. Von jeder Unkrautart wurden bis zu 15 Proben gesammelt, mit Ausnahme von C. arvensis (25). Die höchste CaPsol-Infektionsrate von 60 % wurde bei C. arvensis und Ambrosia artemisiifolia L. festgestellt, gefolgt von Datura stramonium L. (44 %) und Amaranthus retroflexus L. (33 %). Solanum nigrum L. und Chenopodium album L. hatten jeweils 20 % positive Proben, während nur 1/9 Sorghum halepense (L.) Pers. war mit CaPsol infiziert. Keine der Proben von Chenopodiastrum hybridum (L.) S. Fuentes, Uotila und Borsch (Chenopodium hybridum L.), Portulaca oleracea L. und Hibiscus trionum L. war positiv für CaPsol (Tabelle 1).

Eine in den Jahren 2020 und 2021 in Zuckerrübenparzelle 1 durchgeführte Cixiiden-Untersuchung ergab das sympatrische Vorkommen von drei Cixiiden-Arten: H. obsoletus (Ca), R. quinquecostatus und R. panzeri. Ein weiterer Cixiid, R. cuspidatus, wurde 2021 in Parzelle 2 gefunden. Die ersten Individuen von R. quinquecostatus wurden am 10. Juni 2020 im Unkrautbereich am nordöstlichen Grenzstreifen von Parzelle 1 nachgewiesen. Die Population erreichte ihren Höhepunkt um den 20. Juni herum und war in den folgenden zwei Wochen sehr zahlreich (30 Individuen pro 10 Durchläufe). Individuen von R. quinquecostatus wurden auch unter den Zuckerrüben im nordöstlichen Abschnitt von Parzelle 1 gefunden, was mit dem später entdeckten RTD-Hotspot zusammenfiel. Individuen von H. obsoletus (Ca) tauchten Ende Juni in Parzelle 1 auf und waren bis zum 20. Juli vorhanden, wobei sie entlang der Grenzstreifen und innerhalb der Parzelle räumlich mit C. arvensis zusammenfielen. Daher war die Population von H. obsoletus verstreut und ihre Häufigkeit schien geringer zu sein als die von R. quinquecostatus (5 Individuen pro 10 Durchläufe).

Im Jahr 2021 tauchte R. quinquecostatus Mitte Juni auf demselben nordöstlichen Grenzstreifen von Parzelle 1 auf, während im erwarteten Zeitraum der höchsten Häufigkeit (20. Juni) die Anzahl der gesammelten Individuen im Vergleich zu 2020 deutlich reduziert war (0–1). Einzelpersonen pro 10 Sweeps). Darüber hinaus war R. panzeri syntopisch mit R. quinquecostatus vorhanden. Insgesamt 37 Reptalus spp. Die Proben wurden gefangen und durch die Kombination von Morphologiebewertungen und einem molekularen Marker, dem ITS2-Gen, identifiziert. R. quinquecostatus war mit 68 % mehrheitlich vertreten, während die übrigen Individuen als R. panzeri identifiziert wurden (Tabelle 2). Die Population von H. obsoletus erschien in Parzelle 1 im gleichen Zeitraum wie im Vorjahr und war erneut entlang der Grenzstreifen und innerhalb der Parzelle verstreut.

Parzelle 2 wurde 2020 als FTE-freie Parzelle bewertet und 2021 auf Cixiiden untersucht. Die einzige in dieser Parzelle gefundene Cixiide war R. cuspidatus, die auf der Ruderalvegetation in einem Graben zwischen der Parzelle und der örtlichen Straße vorkam. Die ersten R. cuspidatus-Individuen wurden Mitte Juni gesammelt und die Population erreichte in den folgenden 10 Tagen eine hohe Häufigkeit (40 Individuen pro 10 Durchläufe). Obwohl Individuen entlang des Grabens gefunden wurden, der dicht mit Gräsern und vereinzelten Dikotyledonen bedeckt war, wurde R. cuspidatus auch auf mehreren Pflanzen von Artemisia vulgaris L angehäuft. Nur mehrere R. cuspidatus-Exemplare wurden in den angrenzenden Zuckerrübenparzellenrand gekehrt, während keine Individuen gefangen wurden innerhalb von Grundstück-2 oder entlang anderer Grundstücksgrenzen.

Zuckerrübenparzelle 1 wurde für die Verfolgung von CaPsol-Stämmen in verschiedenen Wirten im Jahr 2020 ausgewählt, da RTD in dieser Parzelle im Jahr 2019 mit epidemischer Schwere auftrat. Die Populationen von R. quinquecostatus und H. obsoletus (Ca) in Parzelle 1 waren beide CaPsol-infiziert im Jahr 2020 (Tabelle 2). Die Population von R. quinquecostatus wies eine hohe CaPsol-Infektionsrate von 67 % auf, wobei mehr als die Hälfte der infizierten Personen den Genotyp STOL (St4) trugen (25/38). Die meisten dieser Stämme (16/25) wurden als dSTOLg (tuf-d/STOL/V2-TA) genotypisiert, während in den verbleibenden 9 Proben die Amplifikation der tuf- und vmp1-Gene nicht erfolgreich war (Tabelle 2; Abb. 1). Der Genotyp Rqg31 (St2) wurde bei 6 Personen gefunden, während der Stamm tuf-b1/BG4560(ST31)/V7-A bei drei Personen nachgewiesen wurde. Außerdem wurden drei neuartige Stempelsequenzvarianten gefunden, jeweils für ein Individuum: St82, St83 und St84 (Abb. 2). Darüber hinaus wurde bei einem R. quinquecostatus-Individuum der zur Tuf-a-Epidemiologie gehörende Genotyp RTD6 (St76) nachgewiesen. Die CaPsol-Infektionsrate der H. obsoletus-Population betrug 42 %, wobei weniger als die Hälfte der infizierten Personen den STOL-Stempel-Genotyp aufwiesen (12/26) (Tabelle 2; Abb. 1). Vier von ihnen waren mit dSTOLg infiziert, zwei mit dem Stamm tuf-b1/STOL/V2-TA, während die Genotypen von sechs CaPsol-Stämmen anhand anderer Gene als stamp nicht charakterisiert wurden. Die meisten CaPsol-Stämme, die H. obsoletus infizieren, gehörten zu den Stempel-Genotypen Rqg31, Rqg50 (St1) und M5 (St28), die jeweils in nahezu gleicher Anzahl von Individuen vorkommen und größtenteils mit dem Genotyp tuf-b1 und den Profilen vmp1 assoziiert sind: V2- TA, V4 oder V14. Eine weitere neuartige Stempelsequenzvariante, St89, wurde bei einer Person entdeckt (Abb. 2).

Genetische Vielfalt von CaPsol-Stämmen, die an verschiedenen Zuckerrüben-RTD-Vorkommen in Rimski Šančevi beteiligt sind: (a) epidemische RTD in Parzelle 1 im Jahr 2020; (b) nicht epidemische FTE in Parzelle 1 im Jahr 2021; (c) „Fehlen von RTD“ in Diagramm 2 im Jahr 2021. CaPsol-Wirte, dargestellt als Kreisdiagramme, werden wie in der Legende angegeben abgekürzt. Die Größe der Kreise entspricht dem Prozentsatz der CaPsol-positiven Proben an der Gesamtzahl der analysierten Proben eines bestimmten Wirts. Die Farben der Diagramme stellen die in der Legende beschriebenen CaPsol-Stämme dar, während die Größe des farbigen Teils des Rings der Prävalenz eines bestimmten Genotyps entspricht. Einzelheiten zu den rosa dargestellten neuartigen Stempelgenotypen finden Sie in den Tabellen 1 und 2 sowie in S1.

Median-Joining-Netzwerk von CaPsol-Stempel-Genotypen, die an der RTD von Zuckerrüben beteiligt sind, assoziiert mit den Genotypen tuf-b1 und tuf-d oder mit unbekannter tuf-Zugehörigkeit. Genotypen, die zuvor in RTD-betroffenen Zuckerrüben entdeckt wurden, sowie Genotypen, die mit R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15 in Italien und Frankreich assoziiert sind, wurden in die Analyse einbezogen 4,16,29. Kreise entsprechen einem bestimmten CaPsol-Stempel-Genotyp. Die Kreisgrößen sind proportional zur Genotyphäufigkeit und die Farben entsprechen dem zugehörigen Wirt, wie in der Legende beschrieben. Die schwarzen Punkte auf den Verbindungslinien stellen die Anzahl der Mutationen dar, ebenso wie die in Fünfecken neben den Verbindungslinien notierten Zahlen. Die roten Punkte im Netzwerk sind mittlere Vektoren, die fehlende oder nicht abgetastete Zwischengenotypen darstellen.

Alle in Parzelle 1 als CaPsol-infiziert festgestellten Unkrautarten trugen den STOL-Stempel-Genotyp. Der CaPsol-Stamm dSTOLg war der einzige in Ch nachgewiesene Stamm. album (3/3) und war in A. artemisiifolia (7/9) weit verbreitet (Tabelle 1; Abb. 1). Es infizierte auch S. nigrum und A. retroflexus. Nur 3/15 CaPsol-positive C. arvensis-Proben waren mit dSTOLg infiziert. Die verbleibenden in dieser Reservoirpflanze nachgewiesenen CaPsol-Stämme stimmten mit der Genotypvielfalt überein, die in der zugehörigen H. obsoletus-Population gefunden wurde (Abb. 1). Bei zwei Genotypen wurde eine Inkonsistenz beobachtet; Rqg50 (4/26 H. obsoletus-Individuen) wurde in C. arvensis nicht gefunden und das neuartige St89 (1/26 H. obsoletus) wurde in keiner der getesteten Pflanzen gefunden. Drei neuartige Stempelsequenzvarianten, die in Unkräutern entdeckt wurden, St78, St79 und St80 (Abb. 2), wurden bei keinem der Cixiiden gefunden. CaPsol-Stämme der Tuf-a-Epidemiologie wurden in vorläufigen Reservoirs gefunden: Multilocus-Genotyp tuf-b2/19-25(St11)/V18 in D. stramonium und RTD6(St76)/V23 in A. retroflexus.

Nachdem der RTD-Ausbruch im Jahr 2020 in Parzelle 1 als epidemisch eingestuft wurde, ergab die Genotypisierung von CaPsol-Stämmen aus 25 RTD-symptomatischen Zuckerrüben das Vorhandensein eines einzigen Stamms in allen analysierten Pflanzen, dSTOLg (Abb. 1; Tabelle S2).

Im Vergleich zu 2020 war die Population von R. quinquecostatus im Jahr 2021 an derselben Mikrostelle (NO-Grenzstreifen) in Parzelle 1 stark reduziert und kommt syntopisch mit R. panzeri vor. Dies führte zu einer Vermischung der Populationen dieser beiden artverwandten Arten, die im Freiland visuell nicht unterschieden werden können. Beide Cixiiden waren CaPsol-infiziert und kamen in geringer Anzahl vor. Die häufiger vorkommende R. quinquecostatus-Population hatte eine niedrigere CaPsol-Infektionsrate (36 %) als R. panzeri (42 %) (Tabelle 2). Fast die Hälfte der mit CaPsol infizierten R. quinquecostatus-Individuen hatten den STOL (St4)-Stempel-Genotyp (4/9), während Rqg31 (St2) bei zwei Individuen vorhanden war und drei neuartige Stempelvarianten ebenfalls entdeckt wurden: St85, St86 und St87 (Abb. 2). Der CaPsol-Stamm dSTOLg wurde in R. panzeri (2/5) gefunden. Der Multilocus-Genotyp tuf-b1/Rqg31/V2-TA wurde in einem R. panzeri zusammen mit einem anderen neuartigen Stempelgenotyp, St88, nachgewiesen (Abb. 2). Obwohl die Häufigkeit von H. obsoletus (Ca) im Jahr 2021 dieselbe war wie im Jahr 2020, war die CaPsol-Infektionsrate höher und erreichte 67 % (20/30). Die Hälfte der H. obsoletus-Individuen war mit Rqg31 (11/20) infiziert, hauptsächlich mit den Genotypen tuf-b1/Rqg31/V2-TA und tuf-b1/Rqg31/V14 (Tabelle 2). Der CaPsol-Genotyp tuf-b1/Rpm35(St3)/V2-TA und zwei neuartige Stempelvarianten, St94 und St95, wurden in dieser Studie nur in der H. obsoletus-Population gefunden. Der STOL-Genotyp wurde im Jahr 2021 nur bei 1/20 CaPsol-positiven H. obsoletus nachgewiesen und war mit dem tuf-b1-Genotyp assoziiert (Abb. 1).

Der RTD-Schweregrad in Parzelle 1 wurde im Jahr 2021 als nicht epidemisch bewertet, da die Bewertung einen signifikanten Rückgang der Anzahl symptomatischer Zuckerrüben im Vergleich zu 2020 ergab, als diese Parzelle von einem epidemischen RTD-Ausbruch betroffen war. In 2021 RTD-symptomatischen Pflanzen wurden insgesamt fünf CaPsol-Genotypen gefunden (Abb. 1; Tabelle S2). Der CaPsol-Stamm dSTOLg war in weniger als der Hälfte der analysierten Zuckerrüben (10/25) vorhanden, was auf einen deutlichen Rückgang der Inzidenz dieses Genotyps hinweist, der im Vorjahr, als die epidemische RTD auftrat, in derselben Parzelle vorherrschend war. Die im Jahr 2021 vorherrschenden CaPsol-Stämme waren tuf-b1/STOL/V2-TA, die in 8/25 Proben nachgewiesen wurden, und die Genotypen tuf-b1/Rqg31 und tuf-b1/M5, die in insgesamt 8 Proben nachgewiesen wurden und mit denselben vmp1-Profilen assoziiert waren wie die im selben Jahr in H. obsoletus nachgewiesenen Stämme (Tabelle S2).

Die FTE-freie Parzelle 2 wurde 2021 für das Szenario „Fehlen von FTE“ in die Untersuchung einbezogen. Der einzige auf Parzelle 2 gefundene Cixiid war R. cuspidatus mit einer Bevölkerungsinfektionsrate von 23 % (Tabelle 2). Der STOL-Stempel-Genotyp dominierte bei R. cuspidatus-Individuen (5/8), während ein Individuum den M5-Genotyp aufwies und zwei Individuen jeweils mit den neuartigen Stempelvarianten St90 und St91 infiziert waren (Abb. 2). Im Jahr 2021 waren in Parzelle 2 keine RTD-Symptome vorhanden und eine weitere Analyse von 15 asymptomatischen Zuckerrüben bestätigte das Fehlen von RTD auf dieser Parzelle.

CaPsol-Stämme, die an allen drei RTD-Vorkommensszenarien beteiligt waren, mit Ausnahme der Stämme mit den Genotypen 19–25 und RTD6 der Tuf-a-Epidemiologie, zeigten eine Zugehörigkeit zu den genetischen Tuf-b-Clustern II und III im genealogischen Netzwerk der Stempel (Abb. 2). Die meisten der neuartigen Stempelsequenzvarianten sind in Cluster III gruppiert und leiten sich vom am häufigsten nachgewiesenen Genotyp STOL (St4) ab. Die anderen 8 neuartigen Stempelgenotypen wurden in Cluster II tuf-b gruppiert, da sie genetisch mit Rqg31 (St2) oder Rqg50 (St1) verwandt sind. Neuartige Stempelgenotypen wurden in jedem der untersuchten mutmaßlichen Cixiid-Vektoren und in zwei vorläufigen Reservoirpflanzenarten gefunden, während von RTD betroffene Feldzuckerrüben alle mit zuvor bekannten CaPsol-Stämmen infiziert waren. Jeder neue Genotyp wurde nur in einer Insekten- oder Pflanzenprobe gefunden, während die Genotypen St10 (Stamm PO) und ST46 (RQ161) aus Cluster I, die zuvor in Italien und Frankreich mit R. quinquecostatus assoziiert waren, nicht gefunden wurden.

Der Tuf-d-Typ war ausschließlich mit dem STOL-Stempel-Genotyp assoziiert, während tuf-b1 meist mit anderen Stempel-Genotypen (Rqg31, M5, Rqg50, Rpm35, BG4560, Vv24) assoziiert war, gelegentlich mit dem STOL-Genotyp assoziiert war und auch mit diesem assoziiert gefunden wurde eine neuartige Stempelsequenzvariante (St81; siehe Tabelle S3b). Die Sequenzierung des tuf-Gens zeigte, dass es keine zusätzlichen Mutationen in Stämmen der Genotypen tuf-b1, tuf-b2 und tuf-d gab und dass alle analysierten Proben zu 100 % mit den Referenzstämmen identisch waren (Zugangsnummern finden Sie in den Tabellen 1 und 20). 2). Ein phylogenetischer Maximum-Likelihood-Baum, der aus 7 veröffentlichten CaPsol-tuf-Genotypen, von denen drei in dieser Studie entdeckt wurden, und Tuf-Sequenzen anderer „Candidatus Phytoplasma“-Arten, die als Außengruppen verwendet wurden, erstellt wurde, gruppierte Tuf-b1- und Tuf-d-Stämme zu einem gut unterstützten System abgelegener Zweig (Abb. 3). Dieser Befund, der durch die genetische Häufung von Stempelgenotypen bestätigt wird (Abb. 2), legt nahe, dass die CaPsol-Stämme tuf-b1 und tuf-d denselben epidemiologischen Zyklus von tuf-b aufweisen. Die anderen Genotypen, tuf-b3, b5 und b6 (identifiziert in Vitis vinifera L.25, 26), sowie die tuf-a- und b2-Genotypen der tuf-a-Epidemiologie zeigten jedoch mehrdeutige genetische Beziehungen (Abb. 3). .

Phylogenetischer Stammbaum mit maximaler Wahrscheinlichkeit, abgeleitet aus CaPsol-tuf-Gensequenzen von tuf-Genotypen, über die in dieser und früheren Studien berichtet wurde. Insgesamt wurden 7 veröffentlichte CaPsol-tuf-Genotypen in die Analyse einbezogen, während vier tuf-Sequenzen der anderen „Candidatus Phytoplasma“-Arten als Außengruppen verwendet wurden. Für CaPsol-Sequenzen werden Stammnamen angegeben, während gem. Die Anzahl der Außengruppen ist zusätzlich in Klammern angegeben. Repräsentative CaPsol-tuf-Stämme aus dieser Studie, die dem Referenzstamm entsprechen, sind fett markiert. Bootstrap-Unterstützungswerte werden neben den Zweigen bereitgestellt.

Reptalus quinquecostatus und H. obsoletus (Ca) aus Parzelle 1 wurden im Jahr 2020 an jeweils 10 gesunden Testpflanzen freigesetzt: fünf Strandschnecken und fünf Zuckerrübensetzlinge. Im Jahr 2021 konnten Versuche mit R. quinquecostatus nicht wiederholt werden, da dieses Cixiid in geringer Anzahl und syntopisch mit R. panzeri vorkam. Tests mit H. obsoletus wurden jedoch an der gleichen Anzahl von Testpflanzen wiederholt und zusätzlich wurde R. cuspidatus aus der RTD-freien Parzelle 2 in einzelne Pflanzenübertragungsversuche aufgenommen.

Ende Juli, 30 Tage nach der Inokulation (30 DAI), entwickelten alle Versuchszuckerrüben, die R. quinquecostatus (2020) und H. obsoletus (2020/2021) ausgesetzt waren, Blatt-RTD-Symptome – Gelbfärbung älterer Blätter mit beginnender Nekrose (Abb. S2a). Während der nächsten zwei Wochen breiteten sich nekrotische Stellen aus, Blätter trockneten und ganze Pflanzen begannen zu welken. Der weitere Rückgang der Pflanzen verlief mehr oder weniger fortschreitend und daher wurden bei einigen von ihnen 50 DAI vor ihrem vollständigen Zusammenbruch Proben genommen (Abb. S2b). Die verbleibenden Testzuckerrüben wurden am geplanten Ende des Experiments, 90 DAI, beprobt, wobei sich verschiedene Blattsymptome entwickelten, hauptsächlich an älteren Blättern, gelegentlich aber auch an jüngeren (siehe verschiedene Blatt-RTD-Symptome in Abb. S2c). . Keine der Versuchszuckerrüben zeigte das auffälligste RTD-Symptom, die gummiartige Pfahlwurzel. Alle inokulierten Strandschnecken (5 von R. quinquecostatus und 10 von H. obsoletus) begannen nach 30 DAI Symptome von Chlorose und Vireszenz zu zeigen und wurden nach 90 DAI beprobt. Übertragungsversuche mit beiden Cixiidenarten führten zur erfolgreichen CaPsol-Infektion aller Versuchspflanzen. Die R. quinquecostatus-Population übertrug nur den dSTOLg-Stamm auf alle Testpflanzen, Zuckerrüben und Strandschnecken (Abb. 4a, b; Tabelle S3a). Auch H. obsoletus übertrug dSTOLg sowohl im Jahr 2020 als auch im Jahr 2021 auf Zuckerrüben, allerdings nur auf 2/5 bzw. 1/5 Testpflanzen. Der von H. obsoletus am häufigsten auf Zuckerrüben übertragene CaPsol-Genotyp war tuf-b1/M5/V14 (4/10), gefolgt von tuf-b1/Rqg31/V14 (2/10). Der CaPsol-Stamm tuf-b1/Vv24/V4 wurde in dieser Studie zum ersten Mal in experimentellen Zuckerrüben nachgewiesen, die mit diesem Vektor inokuliert wurden. Die Vielfalt der CaPsol-Genotypen in von H. obsoletus inokulierten Strandschnecken entsprach weitgehend der Vielfalt der Genotypen, die ihre Population auf Zuckerrüben übertrug (Abb. 4a, b; Tabelle S3a).

Streudiagramm der CaPsol-Stämme, die von den drei Cixiiden-Arten auf Versuchspflanzen übertragen wurden: R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15, H. obsoletus (Ca) und R. cuspidatus. (a) einzelne Zuckerrüben; (b) einzelne Strandschnecken; (c) Zuckerrüben in Halbfeldkäfigversuchen. Auf Versuchspflanzen übertragene CaPsol-Multilocus-Genotypen sind auf der x-Achse markiert, während die Anzahl der infizierten Testpflanzen auf der y-Achse markiert ist. Jeder der drei Vektoren wird wie in der Legende beschrieben durch einen Kreis dargestellt. Farbige Lichthöfe entsprechen einem spezifischen RTD-Schweregrad, d. h. wo und wann Vektorpopulationen beprobt wurden. Der blaue Hintergrund hebt dSTOLg hervor, den CaPsol-Stamm, der in RTD-betroffenen Zuckerrüben beim epidemischen RTD-Auftreten im Jahr 2020 vorherrscht, während der gelbe Hintergrund CaPsol-Stämme umfasst, die in RTD-betroffenen Zuckerrüben beim nicht-epidemischen Krankheitsauftreten im Jahr 2021 vorherrschen.

Keine der Zuckerrüben, die R. cuspidatus ausgesetzt waren, entwickelte RTD-Symptome, noch zeigten Strandschnecken eines der typischen Phytoplasma-Infektionssymptome, und daher wurden alle Pflanzen 90 DAI lang als asymptomatisch beprobt. Dennoch führten Übertragungsversuche mit R. cuspidatus zu einer erfolgreichen CaPsol-Infektion von 3/5 Zuckerrüben und 3/5 Strandschnecken. Die meisten der übertragenen CaPsol-Stämme konnten nicht auf anderen Genen als stamp genotypisiert werden, dennoch herrschte der STOL-Genotyp vor (Abb. 4a, b; Tabelle S3a). Der dSTOLg-Stamm wurde von R. cuspidatus zusammen mit zwei neuartigen Stempelvarianten übertragen: St93 – nachgewiesen in experimentellen Zuckerrüben, und St92 – gefunden im Immergrün (Abb. 2; Abb. 4a, b; Tabelle S3a).

CaPsol-Versuche mit Zuckerrüben, die in Netzkäfigen unter Halbfeldbedingungen auf Zuckerrübenparzelle 2 durchgeführt wurden (Abb. S3a), zeigten einen drastischen Unterschied in der Übertragungsfähigkeit der getesteten H. obsoletus (Ca)- und R. cuspidatus-Populationen. Blattsymptome von RTD traten nach 30 Tagen in einem Käfig mit freigesetztem H. obsoletus auf. Mitte August, dem 45. Tag des Tages, begannen die meisten symptomatischen Zuckerrüben zu verfallen, es kam zu fortschreitender Nekrose und Welke. Vor ihrem vollständigen Rückgang wurden 32 Zuckerrüben, die stark von RTD betroffen waren, entwurzelt und 50 DAI beprobt (Abb. S3b). Alle diese Zuckerrübenpflanzen hatten gummiartige Pfahlwurzeln. Von den acht Pflanzen, die bei 90 DAI am Leben blieben, hatten vier leichte Blattsymptome und vier waren asymptomatisch, während keine eine gummiartige Pfahlwurzel aufwies. Alle 32 Zuckerrüben mit typischen RTD-Symptomen waren mit CaPsol infiziert, ebenso wie vier Zuckerrüben mit leichten Blattsymptomen. Die verbleibenden vier asymptomatischen Pflanzen waren CaPsol-negativ. Wie in einzelnen Pflanzentests dominierte der CaPsol-Genotyp tuf-b1/Rqg31 in Zuckerrüben, die in einem Käfig mit H. obsoletus (25/36) inokuliert wurden, insbesondere Stämme, die mit V2-TA- und V14-vmp1-Profilen assoziiert sind (Abb. 4a, c; Tabelle S3a,b). Zehn Zuckerrüben wurden mit dem Genotyp tuf-b1/M5 infiziert, der hauptsächlich mit dem V14-Profil assoziiert ist (9/10), der auch in einzelnen Pflanzenversuchen übertragen wurde (4/10 Zuckerrüben, 3/10 Strandschnecken). Ein CaPsol-Genotyp mit einer neuartigen Stempelvariante, tuf-b1/St81/V2-TA, wurde nur auf eine Zuckerrübenpflanze übertragen (Abb. 2; 4c).

Im Käfig mit freigesetztem R. cuspidatus blieben alle 40 Zuckerrüben bei 90 DAI asymptomatisch. Obwohl asymptomatisch, waren 4/40 Pflanzen CaPsol-positiv und mit Stämmen des STOL-Stamp-Genotyps infiziert, die alle nicht anhand anderer Gene als Stamp charakterisiert waren, wie in einzelnen Pflanzenversuchen festgestellt wurde (Abb. 4c; Tabelle S3a, b). Alle 40 Zuckerrüben aus dem Kontrollkäfig, die keinen Insekten ausgesetzt waren, waren ebenfalls 90 DAI asymptomatisch (Abb. S3c) und wurden negativ auf CaPsol getestet (Tabelle S3b).

Unsere früheren Untersuchungen zum Auftreten von RTD in der Pannonischen Tiefebene haben gezeigt, dass die Krankheit räumlich erheblich variieren kann4, was darauf hindeutet, dass lokale epidemiologische Aspekte eine wichtige Rolle bei der Schwere der Krankheit spielen. In dieser epidemiologischen Studie wurden drei FTE-Vorkommensszenarien: epidemisch, nicht epidemisch und „Fehlen von FTE“ in zwei Vegetationsperioden (2020–2021) auf dem Zuckerrübenfeld in Rimski Šančevi erfolgreich bewertet. schwankendes Versuchspolygon. Als Ergebnis wurden drei CaPsol-Cixiid-Vektoren in situ entdeckt, jeder in einem spezifischen RTD-Szenario: (1) R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15, erstmals als CaPsol-Vektor für eine Kulturpflanze (Zuckerrübe) identifiziert. und als schuldig für den RTD-Ausbruch im Jahr 2020 (Epidemieszenario) vorgeschlagen; (2) Der prominente CaPsol-Vektor, H. obsoletus (Ca), wurde als Bedrohung für die Zuckerrübe identifiziert und in die Liste der Nutzpflanzen aufgenommen, auf die dieser Vektor abzielt (nicht epidemisches Szenario), während (3) R. cuspidatus, der im Szenario „Fehlen von RTD“ bewertet wurde, wurde experimentell als neuartiger CaPsol-Vektor bestätigt, allerdings mit einer vernachlässigbaren Rolle beim Auftreten von RTD in Rimski Šančevi.

Die Population von R. quinquecostatus, die während des RTD-Ausbruchs 2020 untersucht wurde, war stark mit CaPsol infiziert (67 %), was mehr war als zuvor gemeldet10,14,16,29,30,31. Der vorherrschende CaPsol-Genotyp in R. quinquecostatus war dSTOLg, der einzige Stamm, der in Feldzuckerrüben gefunden wurde, die in situ vom Ausbruch der RTD-Epidemie betroffen waren. Übertragungsversuche zeigten, dass dSTOLg der einzige CaPsol-Stamm war, den dieses Cixiid auf Versuchspflanzen übertrug, was darauf hindeutet, dass R. quinquecostatus der schuldhafte Vektor für den RTD-Ausbruch im Jahr 2020 in Rimski Šančevi sein könnte. Das Vorherrschen bestimmter CaPsol-Stämme in epidemiologischen Zyklen im Zusammenhang mit R. quinquecostatus (PO in Italien, RQ161 in Frankreich, dSTOLg-Genotyp in Serbien) legt nahe, dass sich CaPsol-Ausbrüche, die eine bestimmte epidemiologische Variable (in diesem Fall Vektor) gemeinsam haben, unabhängig voneinander in verschiedenen Mikro- Umgebungen. Der CaPsol-Genotyp STOL(St4)/V2-TA, der zuvor in R. quinquecostatus in Serbien gefunden wurde, war mit dem Tuf-b-Typ assoziiert, seine Zugehörigkeit zu den Tuf-b1- oder Tuf-d-Genotypen bleibt jedoch unklar, da es sich ausschließlich um das HpaII-Enzym handelt kann den TUF-D-Typ nicht unterscheiden3,10,14. Obwohl in Rimski Šančevi fünf vorläufige Reservoirpflanzen gefunden wurden, die mit tuf-d infiziert waren, worüber kürzlich auch bei C. foetida und Daucus carota L. in Serbien berichtet wurde32, sind die Häufigkeit und epidemiologische Relevanz des tuf-d-Typs in CaPsol-Zyklen des Die TUF-B-Epidemiologie muss noch evaluiert werden. In der untersuchten R. panzeri-Population wurden auch andere CaPsol-Stämme als dSTOLg nachgewiesen, was ihre Rolle bei RTD derzeit unklar macht.

Die Beteiligung von H. obsoletus (Ca) an der RTD war nicht überraschend, da dieses Cixiid ein prominenter CaPsol-Vektor in Serbien ist8,10,12. Noch wichtiger ist, dass es in Frankreich als Überträger von CaPsol vom Typ tuf-b auf Zuckerrüben berichtet wurde18. Die Inzidenz von dSTOLg war bei H. obsoletus deutlich geringer als bei R. quinquecostatus, und dSTOLg wurde von H. obsoletus weniger erfolgreich auf einzelne Testpflanzen übertragen. Darüber hinaus war im Halbfeldkäfigtest mit H. obsoletus keine der Zuckerrüben mit dSTOLg infiziert. Die am häufigsten von H. obsoletus übertragenen CaPsol-Stämme waren tuf-b1/Rqg31/V4 und tuf-b1/Rqg31/V14, wobei letztere bereits im epidemiologischen Zyklus von H. obsoletus (Ca) in Serbien gemeldet wurden12. Unabhängig vom RTD-Schweregrad veränderte sich die Diversität der von H. obsoletus übertragenen CaPsol-Stämme nur sehr wenig. Im Jahr 2021 war H. obsoletus das vorherrschende Cixiid in Parzelle 1 mit einer hohen Infektionsrate (67 %), dennoch trat RTD nicht mit epidemischer Schwere auf. Obwohl seine hohe Effizienz bei der Übertragung von CaPsol bestätigt wurde, deutete die molekulare Typisierung darauf hin, dass H. obsoletus nicht für den dSTOLg-Ausbruch in der Zuckerrübenparzelle 1 im Jahr 2020 verantwortlich war. Ein Zuckerrübenfeld in Bačko Gradište (Serbien), das im Jahr 2020 als bewertet wurde, wurde jedoch bestätigt ein Ort mit epidemischem RTD-Aufkommen, wies in geringem Maße den dSTOLg-Stamm auf (5/15 CaPsol-infizierte Zuckerrüben)4. Dieser Befund legt nahe, dass andere CaPsol-Stämme zur Schwere der RTD-Epidemie beitragen können und dass andere Vektoren wie H. obsoletus am RTD-Ausbruch beteiligt sein könnten. Die untergeordnete Rolle von H. obsoletus (Ca) oder seine Nichtbeteiligung an CaPsol-Ausbrüchen wurde bereits früher für andere Nutzpflanzen berichtet oder vermutet13,14,16,29,31. Unsere Ergebnisse, die molekulare Epidemiologie und Übertragungstests zusammenstellen, zeigen, dass R. quinquecostatus ein prominenter CaPsol-Vektor sein kann, selbst wenn er in Sympatrie mit einem anderen Vektor vorhanden ist, wodurch die Relevanz von R. quinquecostatus von einem Vektor, der möglicherweise für alternative epidemiologische CaPsol-Zyklen verantwortlich ist, erhöht wird. zu einem Cixiid, das allein für Krankheitsausbrüche verantwortlich ist.

Obwohl die getestete R. cuspidatus-Population in der Nähe (in) der Zuckerrübenparzelle 2 aktiv war und zwei Jahre lang „keine RTD“ aufwies, ergaben Übertragungsversuche, dass R. cuspidatus ein CaPsol-Vektor ist, der Immergrün- und Zuckerrübenpflanzen infizieren kann. Die getestete R. cuspidatus-Population zeigte im Vergleich zu R. quinquecostatus und H. obsoletus eine geringere Übertragungskapazität, insbesondere in Halbfeldkäfigversuchen, bei denen nur 10 % der Zuckerrüben mit CaPsol infiziert waren. Wenn man bedenkt, dass in Frankreich experimentell mit CaPsol infizierte Zuckerrüben 5 Monate nach der Inokulation Krankheitssymptome zeigten18, kann das Fehlen beobachtbarer Symptome in unserer Studie eine Folge der frühen Entwurzelung sein, die 90 Tage nach der Impfung (3 Monate) durchgeführt wurde. Reptalus cuspidatus wurde bereits zuvor als CaPsol-infiziert gemeldet und steht im Verdacht, an „Bois Noir“ beteiligt zu sein33,34. Die Präferenz ihrer erwachsenen Pflanzen für A. vulgaris wurde auch aus Italien berichtet, wo sich herausstellte, dass die Pflanze CaPsol-positiv war34,35. Obwohl die CaPsol-Infektionsrate der R. cuspidatus-Population in Rimski Šančevi 24 % betrug und damit höher war als zuvor berichtet34, scheint ihre Rolle bei der RTD in Rimski Šančevi gering bis vernachlässigbar zu sein, während die Beteiligung an anderen epidemiologischen CaPsol-Zyklen noch untersucht werden muss. Alle CaPsol-Stämme, die R. cuspidatus infizierten oder auf Versuchspflanzen übertragen wurden, gehörten zur Tuf-b-Epidemiologie. Mit dem Genotyp tuf-b2 assoziierte Stämme, von denen zuvor festgestellt wurde, dass sie R. cuspidatus in der Schweiz infizieren34, wurden in unserer Studie nicht nachgewiesen.

Das Vorhandensein des Stempelgenotyps RTD6 (St76) in R. quinquecostatus, der zur Tuf-a-Epidemiologie gehört, bestätigt frühere Ergebnisse16,31. Im Gegensatz zum übereinstimmenden Vorkommen des St6-Stamp-Genotyps (assoziiert mit U. dioica) in R. quinquecostatus und Weinreben in Frankreich16 war keine der analysierten Zuckerrüben aus Parzelle 1 mit Stämmen der Tuf-a-Epidemiologie infiziert, obwohl dies beim RTD6-Genotyp der Fall war In-situ-Infektion der R. quinquecostatus-Population. RTD6 wurde jedoch in einer vorläufigen Reservoirpflanze (A. retroflexus) in Parzelle 1 gefunden und wurde zuvor in Zuckerrüben an anderen Orten nachgewiesen, an denen nicht epidemische RTD auftrat4. CaPsol-Stämme der Tuf-a-Epidemiologie wurden in RTD-betroffenen Zuckerrüben in der gesamten Pannonischen Tiefebene selten gefunden4, während sich H. obsoletus ex U. dioica zuvor bei CaPsol-Übertragungen auf Zuckerrüben als unwirksam erwiesen hatte18.

Die Gene, auf die bei der Genotypisierung von CaPsol-Stämmen abzielt, die an RTD in Rimski Šančevi beteiligt sind, lieferten zuverlässige Einblicke in die Krankheitsepidemiologie. Die inkonsistente Amplifikation der tuf- und vmp1-Gene störte die Rekonstruktion der CaPsol-Signalwege nicht wesentlich, obwohl über dieses Phänomen bereits berichtet wurde4,29,36,37. Das auffälligste RTD-Symptom, die gummiartige Pfahlwurzel, wurde von keiner der in den einzelnen Pflanzenimpfungstests infizierten Zuckerrüben entwickelt, wahrscheinlich aufgrund des regelmäßigen Bewässerungsregimes. Im Gegensatz dazu wurden Zuckerrüben, die in Käfigversuchen mit H. obsoletus beimpft wurden und später die charakteristischen gummiartigen Symptome zeigten, Umweltbedingungen ausgesetzt, darunter geringe Niederschlagsmengen, die über einen Zeitraum von fünf Monaten (Mai–September 2021) durchschnittlich 221 mm betrugen. . Die Cixiid-Zikadenart P. leporinus wurde in Rimski Šančevi nicht nachgewiesen, und bei der Probenahme wurden auch keine Nester oder Nymphen einer Cixiid-Art in der Rhizosphäre der Zuckerrübe gefunden. Das sympatrische Vorkommen von R. quinquecostatus, R. panzeri, R. cuspidatus und H. obsoletus (Ca) wurde 2021 an Feldrändern und innerhalb von Zuckerrübenkulturen an anderen Standorten in Nordserbien beobachtet (unveröffentlichte Daten). Da R. quinquecostatus in verschiedenen Kulturpflanzen vorkommt10,13,14, sind seine Populationen höchstwahrscheinlich eher mit Pflanzen der spontanen Vegetation verbunden, die in der Nähe oder innerhalb von Ackerland wachsen, als mit Kulturpflanzen. Agrarökosysteme bieten Vektoren eine neuartige biotische Umgebung. Darüber hinaus ziehen stickstoffbasierte Düngepraktiken Auchenorrhyncha-Arten an38, was zur Ansammlung von Vektorpopulationen auf Nutzpflanzen, Unkräutern und Ruderalvegetation führt. Letztendlich können sich Vektoren an Nutzpflanzen anpassen, wie es für R. panzeri und P. leporinus dokumentiert ist13,39.

Durch CaPsol verursachte Pflanzenkrankheiten äußern sich oft in wiederkehrenden Epidemien. Nach einem CaPsol-Ausbruch, der zu erheblichen Ertragsverlusten führen kann, tritt die Krankheit in eine Eindämmungsphase ein, in der sie unterdrückt wird und im Zusammenhang mit agroökonomischen Verlusten irrelevant wird. Die zeitliche Diskrepanz bei der Identifizierung von CaPsol-Vektoren und Reservoirpflanzen sowie der Bewertung des durch CaPsol an der Kulturpflanze verursachten Schadens ist das Haupthindernis bei der Vorhersage des Auftretens und der Schwere von Krankheiten. Die gezielte Bekämpfung wichtiger Vektoren, ihrer Wirtspflanzen und CaPsol-Inokulumreservoirs ist derzeit die wirksamste Vorsichtsmaßnahme, die bei der Vorwegnahme des Auftretens einer Krankheit umgesetzt werden kann.

Diese Studie zur FTE-Epidemiologie wurde von April bis Oktober in zwei aufeinanderfolgenden Jahren, 2020 und 2021, auf dem experimentellen Zuckerrübenfeld des Instituts für Feld- und Gemüsepflanzen in Rimski Šančevi (Novi Sad, Vojvodina, Nordserbien), also zwei, durchgeführt Zuckerrübenparzellen im Abstand von 1,2 km: Parzelle 1 mit 5 ha und Parzelle 2 mit 2 ha. Zuckerrüben der zertifizierten Hybride „Original“ wurden wie zuvor beschrieben3 ausgesät und gepflegt.

Alle in dieser Studie angewandten Methoden, einschließlich der Probenahme, entsprachen den serbischen Richtlinien und Gesetzen. Der Zugang zum Versuchsfeld wurde gewährt und die Erlaubnis zur Probenentnahme wurde vom Institut für Feld- und Gemüsebau in Novi Sad eingeholt.

Beide Zuckerrübenparzellen wurden Mitte September 2020 und 2021 auf das Vorliegen von RTD-Symptomen untersucht. Der Schweregrad des RTD-Auftretens wurde gemäß der zuvor beschriebenen Methodik4 bewertet. In jedem Jahr wurden 25 Zuckerrüben mit RTD-Symptomen aus Parzelle 1 beprobt. Fünfzehn zuvor gemeldete Zuckerrüben mit RTD-Symptomen aus der im Jahr 2020 beprobten Parzelle 14 wurden für diese Studie durch weitere zehn symptomatische Pflanzen aus demselben Jahr und derselben Parzelle ergänzt. Da auf Parzelle 2 keine RTD-Symptome auftraten, wurden jedes Jahr 15 asymptomatische Zuckerrüben gesammelt. Alle beprobten Pflanzen wiesen keine Anzeichen oder Symptome eines anderen Wurzelpathogens oder Schädlings auf. Zur weiteren Analyse wurde eine Probe von einem halben Gramm Pfahlwurzelgewebe entnommen. Die Bestandsaufnahme der vorläufigen Reservoirpflanzen in Parzelle 1 erfolgte im Juni 2020. Die Symptome einer Phytoplasma-Infektion bei Unkräutern wurden bis Mitte September überwacht, als eine Probenahme der Blätter (ein halbes Gramm) durchgeführt wurde. Die Anzahl der gesammelten Proben entsprach der Häufigkeit eines bestimmten Unkrauts. Alle Zuckerrübenwurzel- und Unkrautblattproben wurden bis zur weiteren DNA-Isolierung bei –20 °C gelagert.

Das Vorkommen von Cixiiden wurde in den Jahren 2020 und 2021 in Zuckerrübenparzelle 1 von Mitte Mai bis Mitte August überwacht, während Parzelle 2 nur im Jahr 2021 inspiziert wurde. Die Insekten wurden in der Regel einmal pro Woche oder häufiger im Juni und Juli gesammelt , mit einem entomologischen Netz und einem Mundsauger. Das Kehren erfolgte innerhalb des Bestandes und entlang der Grenzstreifen. Die gesammelten Insekten wurden in 96 %igem Ethanol gelagert und unter einem Leica S9E-Stereomikroskop anhand der äußeren Morphologie und der männlichen Genitalien identifiziert15.

Reptalus quinquecostatus wurde kürzlich einer taxonomischen Überarbeitung unterzogen40. Dieses Cixiid wurde in ganz Europa unter dem Namen „R. quinquecostatus‘ als hochwirksamer CaPsol-Vektor, der vermutlich an mehreren Pflanzenkrankheiten beteiligt ist10,14,16,29,31. Um eine Rückverfolgbarkeit auf veröffentlichte Daten zu dieser Art zu gewährleisten, haben wir sie in unserer Forschung als R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15 bezeichnet. Die Identität der Männchen von R. quinquecostatus und R. panzeri wurde durch morphologische Unterschiede im Analrohr bestimmt, dh durch das Vorhandensein eines deutlichen Fortsatzes mit einer Linksorientierung bei R. quinquecostatus, der bei R. panzeri fehlt. Die weiblichen Exemplare dieser beiden artverwandten Arten konnten nicht zuverlässig unterschieden werden und wurden daher einer molekularen Identifizierung unterzogen. Der interne transkribierte Spacer 2 (ITS2) der ribosomalen DNA wurde unter Verwendung des Primerpaars ITS2fw/ITS2rv in einem 25 μl Endreaktionsvolumen amplifiziert, das 2 μl Template-DNA (isoliert wie unten beschrieben), 1 × PCR Master Mix (Thermo Scientific, Vilnius) enthielt , Litauen) und 0,4 µM jedes Primers unter den zuvor beschriebenen thermischen Bedingungen41,42. Da ausgewachsene R. cuspidatus im Gegensatz zu den beiden anderen Reptalus-Arten15 Plättchen auf dem ersten Segment des hinteren Tarsus tragen, wurde der RFLP-Verdau der ITS2fw/ITS2rv-Amplifikate mit dem TaqI-Enzym bei der weiteren Analyse weggelassen. Daher wurde die Zugehörigkeit der Weibchen zu R. quinquecostatus oder R. panzeri nur auf der Grundlage von Unterschieden in der Länge der in PCR42 erhaltenen ITS2-Amplifikate bestimmt.

Die DNA-Isolierung aus Feld- und Versuchspflanzen erfolgte nach dem CTAB-Protokoll43. Genomische DNA einzelner Insekten wurde mithilfe einer modifizierten CTAB-Methode17 isoliert. Da das angewandte Extraktionsverfahren die Homogenisierung von Insekten beinhaltet, wurden zuvor Aedeagi von 10 Männchen pro Art/Population entnommen und in Glycerin bei 4 °C gelagert. Isolierte DNA wurde bis zur weiteren Analyse bei –20 ° C aufbewahrt. Der CaPsol-Nachweis in Pflanzen und Insekten basierte auf der Amplifikation des CaPsol-spezifischen Stempelgens in der Nested-PCR mit den Primern StampF/R0 und StampF1/R144. Als Positivkontrolle wurde der CaPsol-Stamm 429/19 verwendet3. Die erhaltenen PCR-Amplikons wurden in 1 %igen Agarosegelen aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht.

Anwesenheit von 'Ca. A. phytopathogenicus“ wurde mithilfe des TaqMan-Echtzeit-PCR-Protokolls verifiziert, das auf das hsp20-Gen (Hitzeschockprotein 20) von „Ca. A. phytopathogenicus'45. Endgültige Reaktionsvolumina von 15 μl enthielten 1 × TaqMan qPCR Master Mix (Nippon Genetics Europe), 1 μl Template-DNA, 0,2 μl Uracil-N-Glycosylase (UNG), 450 nM jedes Primers und 200 nM Sonde. Die qPCR wurde in einem Magnetic Induction Cycler, Mic (Bio Molecular Systems, Australien) mit den zuvor beschriebenen Zyklusparametern durchgeführt45. Jede Reaktion umfasste einen DNA-freien Blindtest, eine Negativkontrolle, die einer RTD-asymptomatischen Zuckerrübe entsprach, und eine Positivkontrolle von 'Ca. A. phytopathogenicus‘, Stamm HN1220/53. Ein zusätzlicher qPCR-Assay, der auf das nad5-Gen (kodiert für die NADH-Ubiquinon-Oxidoreduktase-Kette 5) von Beta vulgaris L. abzielt, unter Verwendung derselben Positivkontrolle (HN1220/5) wurde separat durchgeführt, um das Vorhandensein zu bestätigen und die Qualität der DNA-Matrize zu bewerten45. Die Datenanalyse wurde mit der micPCR©-Software Version 2.6.4 (Bio Molecular Systems, Australien) durchgeführt.

Alle CaPsol-Stämme aus im Feld gesammelten Zuckerrüben, Unkräutern, Insekten und Versuchspflanzen wurden einer molekularen Typisierung an drei Genen unterzogen: stamp, tuf und vmp1. Das Endvolumen des PCR-Mixes für jede Reaktion enthielt 1 μl der verdünnten (1:50) extrahierten DNA für Pflanzenmaterial oder 2 μl der isolierten Insekten-DNA, 1 × PCR-Master-Mix und 0,4 μM jedes Primers. Jedes der drei Gene wurde in der entsprechenden verschachtelten Reaktion unter Verwendung von 1 μl direktem PCR-Produkt, 5 × verdünnt in sterilem Wasser, amplifiziert.

Verschachtelte Stempelgensequenzen wurden kommerziell von Macrogen Inc. (Seoul, Südkorea) bezogen, mit FinchTV v. 1.4.0 (http://www.geospiza.com) bearbeitet und mit CaPsol-Referenzstämmen unter Verwendung von ClustalX, das in die MEGA 5-Software integriert ist, abgeglichen . Die Zugangsnummern der 18 in der GenBank hinterlegten neuartigen Stempelgenotypen/Sequenzvarianten sind in den Tabellen 1 und 2 sowie in Tabelle S1 aufgeführt. Spezifische „St“-Codes wurden den Stempelgenotypen zugewiesen, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie an RTD4 beteiligt sind, und den in dieser Studie beschriebenen Genotypen, wodurch die Liste der Stempelsequenzvarianten 28, 29 (Tabelle S1) fortgesetzt wird. Die genetische Verwandtschaft von CaPsol-Stämmen, basierend auf dem Stempelgen, wurde durch ein phylogenetisches Median-Joining-Netzwerk bewertet, das mit NETWORK Version 10.2 (www.fluxus-engineering.com) erstellt wurde47. Die angewendeten Einstellungen hatten einen Standardwert von 0 für den ε-Parameter und maximale Sparsamkeit bei der Nachbearbeitung, um ein Netzwerk zu erhalten, das alle kürzesten Bäume enthielt. CaPsol-Stämme, die zur Tuf-b-Epidemiologie gehören und über die zuvor4 und in dieser Studie als an RTD beteiligt berichtet wurden, sowie die Stämme PO (St10) und RQ161 (St46), die in R. quinquecostatus in Italien und Frankreich nachgewiesen wurden16,29, wurden einer MJ-Analyse unterzogen . Das tuf-Gen wurde durch die Kombination zweier PCR-Verfahren amplifiziert, abhängig von der Amplifikationseffizienz: ein verschachteltes Protokoll mit den Primerpaaren fTuf1/rTuf1 und fTufAY/rTufAY21,48 und ein halbverschachteltes Protokoll mit den Primern fusAF1/tufBR1 und fusAF2/tufBR149. Die weitere Identifizierung des Tuf-Typs/Genotyps der analysierten CaPsol-Proben erfolgte wie zuvor beschrieben4. Das tuf-Gen repräsentativer CaPsol-Stämme jedes Multilocus-Genotyps, der in jedem Wirt gefunden wurde, wurde sequenziert, um das Vorhandensein zusätzlicher genetischer Variabilität innerhalb der erkannten tuf-b- und tuf-d-Typen zu überprüfen. Insgesamt 28 repräsentative Tuf-Sequenzen, die gleichmäßig über Genotypen und Wirte verteilt sind, wurden in der GenBank hinterlegt (Zugangsnummer OP231764-OP231791). Ein Maximum-Likelihood-Baum wurde in der MEGA Als Außengruppen wurden Sequenzen des tuf-Gens von drei anderen „Candidatus Phytoplasma“-Arten verwendet: „Ca. P. fragariae“, „Ca. P. australiense“ und „Ca. P. asteris'. Eintausend Bootstrap-Replikationen wurden durchgeführt, um die statistische Signifikanz der abgeleiteten Kladen abzuschätzen. Die Amplifikation des vmp1-Gens wurde in Nested-PCR-Assays unter Verwendung der Primer StolH10F1/R1 und TYPH10F/R36,51 durchgeführt. Die Identifizierung der vmp1-Profile der analysierten CaPsol-Proben erfolgte wie zuvor beschrieben4.

Übertragungsversuche von CaPsol auf gesunde Zuckerrüben- und Immergrünpflanzen über natürlich infizierte Populationen mutmaßlicher Cixiid-Vektoren wurden in zwei Versuchsaufbauten durchgeführt: (1) Einzelpflanzenversuche in den Jahren 2020 und 2021 und (2) Halbfeldversuche im Jahr 2021 auf Zuckerrübenparzelle-2. In beiden Versuchen wurde die zertifizierte Zuckerrübenhybride „Original“ verwendet. Pflanzen für Einzelpflanzentests wurden Mitte April gesät, in pathogenfreie Erde gepflanzt und in einer Klimakammer bei 24 ± 1 °C (16/8 Stunden Licht-/Dunkelperiode) gehalten. Drei Cixiid-Arten wurden in die Versuche aufgenommen, nachdem die CaPsol-Infektion von Insekten anhand der Analyse einer repräsentativen Anzahl von Individuen verifiziert wurde. Populationen von R. quinquecostatus und H. obsoletus (Ca) aus Parzelle 1 wurden im Jahr 2020 in Einzelpflanzenexperimenten getestet. Im Jahr 2021 konnten Tests mit R. quinquecostatus nicht wiederholt werden, da es in geringer Anzahl und syntopisch mit R. panzeri vorkam. Allerdings wurden Versuche mit H. obsoletus wiederholt und zusätzlich wurde R. cuspidatus aus Parzelle 2 in Einzelpflanzenversuche im Jahr 2021 einbezogen. Die Insekten wurden Ende Juni gesammelt und auf einzelnen Versuchspflanzen freigelassen, die zuvor mit Plastik abgedeckt waren Zylinder, mit Belüftung versehen. Für die Tests jedes mutmaßlichen Vektors wurden pro Jahr fünf Zuckerrüben und fünf Strandschnecken verwendet. Jede Versuchspflanze beherbergte 72 Stunden lang 30 Individuen einer bestimmten Art. Anschließend wurden die Insekten gesammelt und in 96 %igem Ethanol gelagert. Versuchszuckerrüben wurden außerdem im Freien in einem Netzkäfig gehalten, während Immergrünpflanzen in einer Klimakammer gehalten wurden. Fünf Kontrollzuckerrüben und Strandschnecken, die keinen Insekten ausgesetzt waren, wurden als Negativkontrollen in das Experiment einbezogen. Alle Pflanzen wurden täglich auf die Entwicklung von Symptomen überwacht und 90 DAI lang beprobt. Pflanzen, deren Rückgang bereits früher begonnen hatte, wurden entsprechend beprobt.

Im Jahr 2021 wurden Halbfeld-CaPsol-Übertragungsversuche auf Zuckerrüben in der Parzelle 2 durchgeführt, die 2020 als FTE-frei bewertet wurde. Am 15. Mai wurden Netzkäfige (2 × 2 × 2,5 m) installiert, die jeweils 40 Pflanzen abdeckten wurden dem gleichen agrotechnischen Protokoll unterzogen wie der Rest der Parzelle. Populationen von H. obsoletus (Ca) aus Parzelle 1 und R. cuspidatus, die auf Ruderalvegetation in einem an Parzelle 2 angrenzenden Graben gefangen wurden, wurden in die Versuche aufgenommen. Ende Juni wurden insgesamt 250 Individuen jeder Art beprobt und jeweils in einen abgelegenen Käfig entlassen. Als Negativkontrolle wurde ein zusätzlicher Käfig ohne Insekten in das Experiment einbezogen. Zuckerrüben in Käfigen wurden einmal pro Woche oder häufiger, abhängig von der Schwere der Symptome und dem Pflanzenrückgang, visuell auf die Entwicklung von Blattsymptomen untersucht. Die Beprobung der Zuckerrüben erfolgte Anfang Oktober, bei rückläufigen Pflanzen erfolgte eine entsprechende Beprobung.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Diese Forschung wurde vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und technologische Entwicklung der Republik Serbien, Verträge 451-03-68/2022-14/200214 und 451-03-68/2022-14/200032, und vom Wissenschaftsfonds unterstützt der Republik Serbien, Programm IDEAS (Grant No 7753882, Rubbery Taproot Disease of Sugar Beet: Etiology, Epidemiology and Control-SUGARBETY).

Labor für Phytopathologie, Institut für Pestizide und Umweltschutz, 11080, Belgrad, Serbien

Andrea Kosovac, Jelena Stepanović, Emil Rekanović und Bojan Duduk

Abteilung für Sonnenblumen, Institut für Feld- und Gemüsepflanzen, 21000, Novi Sad, Serbien

Živko Ćurčić

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AK und BD haben Experimente entworfen. AK, BD, Ž.Ć. und ER bereitete Experimente vor und führte sie durch. Ž.Ć. und ER organisierte und unterhielt experimentelle Feld- und Halbfeldexperimente mit Zuckerrüben. AK hat Insekten identifiziert. AK, JS und BD führten eine molekulare Analyse durch. AK, JS und BD analysierten Daten. AK und BD haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Andrea Kosovac.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kosovac, A., Ćurčić, Ž., Stepanović, J. et al. Epidemiologische Rolle des neuen und bereits bekannten „Ca. P. solani‘ cixiid-Vektoren bei der Gummipfahlwurzelkrankheit von Zuckerrüben in Serbien. Sci Rep 13, 1433 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28562-8

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Eingegangen: 18. August 2022

Angenommen: 20. Januar 2023

Veröffentlicht: 25. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28562-8

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