Elektronen-Kryo

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7411 (2022) Diesen Artikel zitieren

5024 Zugriffe

2 Zitate

97 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Pili sind filamentöse Oberflächenverlängerungen, die bei bakteriellen und archaealen Zellprozessen wie Adhäsion, Biofilmbildung, Motilität, Zell-Zell-Kommunikation, DNA-Aufnahme und horizontalem Gentransfer eine Rolle spielen. Das Modellarchaea Sulfolobus acidocaldarius setzt drei Filamente der Typ-IV-Pilus-Superfamilie (Archaella, archaeale Adhäsionspili und UV-induzierbare Pili) sowie ein bisher nicht charakterisiertes viertes Filament zusammen, das als „Faden“ bezeichnet wird. Hier berichten wir über die Kryo-EM-Struktur des Archaeenfadens. Das Filament ist stark glykosyliert und besteht aus Untereinheiten des Proteins Saci_0406, die in einer Kopf-an-Schwanz-Anordnung angeordnet sind. Saci_0406 weist strukturelle Ähnlichkeit, aber geringe Sequenzhomologie zu bakteriellen Typ-I-Pilinen auf. Fadenuntereinheiten sind durch Donorstrangkomplementierung miteinander verbunden, ein Merkmal, das an bakterielle Chaperon-Usher-Pili erinnert. Trotz dieser Ähnlichkeiten in der Gesamtarchitektur scheinen sich archaische Fäden jedoch unabhängig voneinander entwickelt zu haben und werden wahrscheinlich durch einen bestimmten Mechanismus zusammengesetzt.

Die Fähigkeit, an Oberflächen zu haften und Biofilme zu bilden, ist für das mikrobielle Leben und die Entwicklung von Krankheiten von entscheidender Bedeutung. Oberflächenadhäsion und Biofilmbildung werden durch verschiedene Filamente gefördert, die von der prokaryotischen Zelloberfläche ausgehen1,2,3,4. Bei Bakterien wurde eine große Vielfalt an Klebefilamenten gut untersucht. Dazu gehören Chaperone-Usher (CU), Curli, Typ-IV- (T4P) und Typ-V-Pili (T5P) bei gramnegativen Bakterien sowie Sortase-abhängige Pili bei grampositiven Bakterien5,6,7,8,9, 10,11.

Bei Archaeen sind Zelladhäsion und Biofilmbildung weitaus weniger verstanden. Bisher gehören die am besten untersuchten adhäsiven Filamente der Archaeen zur Typ-IV-Pilus-Superfamilie (T4FF)12,13,14,15. T4FF sind in Bakterien und Archaeen konserviert und bestehen aus helikal organisierten lollipopförmigen Untereinheiten, den sogenannten Typ-IV-Pilinen (T4P). T4P zeichnen sich durch eine konservierte hydrophobe N-terminale α-Helix und einen variablen globulären C-Terminus aus, der reich an β-Strängen ist. T4FF haben einen gemeinsamen Montageweg. Die Untereinheiten werden zunächst als Präpiline exprimiert und durch das Sec-Translokon16 in die Zellmembran eingefügt. Nach der Spaltung des N-terminalen Signalpeptids durch eine Klasse-III-Signalpeptidase werden die Piline für die Insertion in ein entstehendes T4FF-Filament vorbereitet, ein Prozess, der durch einen membrandurchspannenden und ATPase-gesteuerten Multiproteinkomplex katalysiert wird17. Im zusammengesetzten Pilus bilden die α-Helices den Kern des Filaments, während die kugelförmigen Domänen dem extrazellulären Medium zugewandt sind18. Die Kooptation und Anpassung homologer Gene im T4FF hat zu einer Vielzahl von T4P-ähnlichen Filamenten mit zusätzlichen Funktionen wie Motilität und DNA-Aufnahme geführt19,20.

Jüngste Erkenntnisse deuten auf die Existenz einer anderen Art archaeischer Klebefilamente21 hin, die Merkmale aufweisen, die an bakterielle Chaperone-Usher (CU)-Pili erinnern. Hierbei handelt es sich um Oberflächenfilamente, die eine Schlüsselrolle bei der Bildung von Biofilmen und der Virulenz pathogener Stämme spielen22. Zu den CU-Pili gehören Typ-I- und P-Pili, die in uropathogenen Escherichia coli vorkommen und es diesen Bakterien ermöglichen, sich an Endothelzelloberflächen anzuheften22,23. Die Bindung an die Zelloberfläche wird durch spezielle Adhäsine vermittelt, die die distalen Enden der Filamente bedecken und selektiv für Zuckerreste in Glykolipidrezeptoren auf den Zelloberflächen des Wirts sind24,25.

Fimbrien sind Hohlfasern, die aus Pilin-ähnlichen Untereinheiten zusammengesetzt sind11. Diese Untereinheiten werden zunächst als Vorläuferproteine exprimiert und vom Sec-Translokon in den periplasmatischen Raum sezerniert26. Untereinheiten für diese Filamente haben eine konservierte Struktur, die aus einer N-terminalen (β-Strang-)Verlängerung (NTE) und einer C-terminalen globulären Domäne mit einer unvollständigen Immunoglobin-ähnlichen Falte (Kopf) besteht. Im zusammengebauten Filament fügt jede Untereinheit ihren Schwanz in das β-Fass einer benachbarten Untereinheit ein, und zwar durch einen Prozess, der als Donor-Strang-Komplementation (DSC) bezeichnet wird27. Dieser Mechanismus, der die Bildung mehrerer Wasserstoffbrückenbindungen mit sich bringt, verkettet die Untereinheiten zu einem äußerst stabilen Filament28.

Der Zusammenbau zu einem Filament findet im Periplasma statt und wird durch den Chaperone-Usher (CU)-Weg29 vermittelt. Hier bindet das Chaperon (FimC in Typ1 und PapD in P-Pili von E. coli) an den entstehenden N-Terminus eines neu synthetisierten Pilins und unterstützt dessen Integration in den wachsenden Pilus30. Ein in die Außenmembran integriertes Barrel-Protein namens Usher leitet die Fimbrien durch die Außenmembran, von wo aus sie sich schließlich bis zu 3000 Untereinheiten in das umgebende Medium erstrecken31,32,33. Die Assemblierung über DSC findet sich auch in Typ-V-Pili (T5P) der gramnegativen Bakterien Porphyromonas gingivalis34 und Salmonella enterica35,36 sowie in sortaseabhängigen Pili (SDP) der grampositiven Bakterien Actinomyces naeslundii und Corynebacterium diphtheriae , Enterococcus faecalis und verschiedene Streptococcus-Arten37. T5P und SDP werden jedoch über Mechanismen zusammengesetzt, die sich vom CU-Weg unterscheiden38.

Das Crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius dient als interessanter Modellorganismus zur Untersuchung von Zelloberflächenstrukturen, da es bei 75 °C und einem pH-Wert von 3 gedeiht und daher die Oberflächenstrukturen an diese extremen Umweltbedingungen angepasst sind39. S. acidocaldarius setzt drei Oberflächenfilamente der T4FF-Familie zusammen; ein Archaellum, archaeale Adhäsionspili (Aap), UV-induzierbare Pili (Ups), die den DNA-Austausch unter UV-Stress erleichtern, sowie ein neuartiges und bisher nicht charakterisiertes Filament mit der Bezeichnung „Faden“40.

Wenn Aap, UV-Pili und Archaella in S. acidocaldarius gelöscht werden, bilden die Zellen immer noch Fäden40. Hierbei handelt es sich um dünne, 5 nm breite Filamente, die auf der Zelloberfläche häufig vorkommen und eine Länge von bis zu mehreren Mikrometern erreichen. Hier präsentieren wir eine Struktur dieses Filaments mit einer Auflösung von 3,45 Å und identifizieren seine Proteinuntereinheit. Die Untereinheiten sind über DSC eng miteinander verbunden, ähnlich wie bei bakteriellen CU-assemblierten Pili. Darüber hinaus scheinen die Untereinheiten über ungewöhnliche N-terminale Isopeptidbindungen kovalent verbunden zu sein. Wir stellen fest, dass die Fäden stark glykosyliert sind und konnten anhand unserer KryoEM-Karte fünf vollständige N-Glykanstrukturen pro Untereinheit in unsere Struktur einbauen. Struktur- und sequenzbasierte bioinformatische Analysen offenbaren eine bisher unbekannte archaeenspezifische Klasse von Zelloberflächenfilamenten.

Obwohl Fäden bereits in den frühen 2000er Jahren40 in S.-acidocaldarius-Zellen beobachtet wurden, waren ihre Struktur und ihr Zusammenbaumechanismus bisher unklar. Die Prepilin-Signalpeptidase PibD (oder Klasse-III-Signalpeptidpeptidase SPIII) ist entscheidend für den Aufbau und die Funktion von Archaella, UV-Pili und Aap-Pili41. Wir haben daher gefragt, ob es auch für die Montage der Gewinde unerlässlich ist. Ein ΔpibD-Deletionsmutant zeigte Fadenfilamente auf seiner Oberfläche, wie mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert (ergänzende Abbildung 1a – c). Daher werden Threads über einen PibD-unabhängigen Weg gebildet und gehören daher nicht zur T4FF-Superfamilie.

Unser Ziel war es, die Struktur des Fadenfilaments mittels Elektronen-Kryo-Mikroskopie (Kryo-EM) aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde ein S. acidocaldarius-Stamm, der nur AAP und Fäden und keine Archaella- oder UV-Pili (MW158) exprimiert, bis zur stationären Phase gezüchtet. Diese Sorte wurde aus zwei Gründen ausgewählt. Erstens ermöglichte es uns, die Fäden zusammen mit einem Referenzfilament mit etablierten Reinigungsparametern und genetischem Hintergrund zu reinigen. Zweitens würde die Analyse zweier strukturell unterschiedlicher Filamente in einer Probe es uns ermöglichen, ihre Strukturen anhand derselben Mikroaufnahmen in zukünftigen Studien zu vergleichen.

Die Filamente wurden von den Zellen abgetrennt und durch CsCl-Gradientenzentrifugation weiter gereinigt. Die resultierende Probe, die eine gemischte Population von Fäden und Aap-Pili enthielt, wurde auf KryoEM-Gittern tauchgefroren, von denen 6272 KryoEM-Filme aufgezeichnet wurden (Ergänzungstabelle 1). Die Korrektur der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) und die Bewegungskorrektur wurden mit CryoSPARC42 durchgeführt, bevor die Filamente automatisch mit dem Filament-Tracer-Programm ausgewählt wurden. Der Datensatz wurde durch mehrere Runden der 2D-Klassifizierung bereinigt, um fälschlicherweise automatisch ausgewählte Aap-Pili und schlecht aufgelöste Thread-Klassen zu entfernen (ergänzende Abbildung 2). Aus unseren 2D-Klassifizierungen ging hervor, dass sich Fäden häufig zu Kabeln ausrichten, die aus mehreren parallelen Filamentsträngen bestehen (ergänzende Abbildung 1h). Ähnliche Kabel wurden in mikroskopischen Aufnahmen von negativ gefärbten S. acidocaldarius-Zellen beobachtet (ergänzende Abbildung 1c), was darauf hinweist, dass die Fäden dazu neigen, aneinander zu haften.

Die Helix Refine-Routine in cryoSPARC ermöglichte 3D-Rekonstruktionen von Filamenten mit niedriger Auflösung, ohne dass Spiralparameter vorgegeben werden mussten42. Die resultierende Karte mit einer Auflösung von 5,54 Å zeigte deutlich, dass das Fadenfilament aus einer helikalen Folge von Untereinheiten besteht (ergänzende Abbildung 3) und ermöglichte es uns, ungefähre helikale Parameter im realen Raum zu bestimmen. Eine Symmetriesuche um diese Werte in cryoSPARC ergab einen klaren Peak mit einem Anstieg von 31,6 Å, der durch eine meridionale Reflexion in mit SPRING berechneten Fourier-Leistungsspektren und einer Drehung von –103,2° bestätigt wurde (ergänzende Abbildung 4)43.

Die Anwendung dieser Werte auf die 3D-Verfeinerung führte zu einer Karte mit einer Auflösung von 4,02 Å, die sich nach mehreren Runden der CTF-Verfeinerung weiter auf 3,45 Å verbesserte. Eine lokale Auflösungsschätzung zeigte, dass die Karte im Kern des Filaments am besten aufgelöst wurde, wo sie eine Auflösung von 3,0 Å erreichte (ergänzende Abbildung 5). Die endgültige Karte ergab, dass das Fadenfilament aus kugelförmigen Proteinuntereinheiten besteht, die von Kopf bis Schwanz angeordnet sind (Abb. 1a).

eine segmentierte Oberflächendarstellung der KryoEM-Karte, die jede Untereinheit in einer anderen Farbe zeigt. Die Glykandichten werden in Weiß angezeigt (weiße Pfeilspitzen). b Das Atommodell einer Saci_0406-Untereinheit (Regenbogen), eingepasst in die CryoEM-Karte (transparentes Grau). N-Terminus, blau; C-Terminus, rot. Glykane sind der Einfachheit halber nicht dargestellt. c Die intermolekulare Isopeptidbindung wird als gestrichelte violette Linie dargestellt. Der N-terminale Rest Asp24 einer Untereinheit (n + 2; Kohlenstoffe in Eisblau) scheint kovalent an zwei Asn57-Untereinheiten entlang der Kette gebunden zu sein (n; Kohlenstoffe in Gold). d Atommodell von 5 aufeinanderfolgenden Saci_0406-Untereinheiten in Banddarstellung. Glykane sind der Einfachheit halber nicht dargestellt. Ein weißer Pfeil zeigt die Position der Donorstrang-Komplementation zwischen der N-terminalen Schwanzdomäne der Untereinheit (n) und der C-terminalen Kopfdomäne der vorherigen Untereinheit in der Kette (n − 1) an. Rote Pfeile zeigen die Lage der Isopeptidbindungen an. Die Schwanzdomäne jeder Untereinheit n ist teilweise in den beiden aufeinanderfolgenden Untereinheiten n − 1 und n − 2 vergraben. e Atommodell des Fadenfilaments mit Glykanen in Stabdarstellung. f–j Nahaufnahmen der fünf in Saci_0406 gefundenen Glykosylierungsstellen. Atommodelle der Glykane sind in Stabdarstellung, das Polypeptidrückgrat in Banddarstellung dargestellt. Die CryoEM-Dichtekarte wird als graues Netz angezeigt. k, l Nahaufnahmen der Karte und des angepassten Atommodells, die die Qualität der Daten veranschaulichen. Das Farbschema ist wie in C, Kette (n-1) zeigt Kohlenstoffe in Korallen. Maßstabsbalken 20 Å.

Wir versuchten, die Fadenuntereinheit mittels Massenspektrometrie zu identifizieren, allerdings erwies sich das Filament als resistent gegenüber der Verdauung mit Trypsin oder der Behandlung mit Guanidinhydrochlorid (GdnHCl). Diese bemerkenswerte Stabilität wurde auch für den LAL/Aap-Pilus von Sulfolobus islandicus sowie für Sulfolobus solfataricus beobachtet12,44.

Aufgrund der Qualität unserer Karte, insbesondere der gut aufgelösten Glykosylierungsstellen, konnte die Untereinheit des Fadens allein anhand seiner Struktur identifiziert werden. Dies geschah, ohne dass die Gensequenz erforderlich war, ähnlich wie bei zuvor beschriebenen Strategien (ergänzende Abbildung 6) 44, 45, 46. Wir haben zunächst eine Polyalaninkette in unsere Karte eingebaut, um die Richtung und Länge des Rückgrats zu bestimmen. Dabei ergab sich, dass die Polypeptidsequenz etwa 206 Aminosäuren lang ist. Aufgrund ihrer besonderen Form und Größe konnten wir die Position charakteristischer Aminosäuren entlang des Rückgrats genau bestimmen. Dazu gehörten aromatische Aminosäuren sowie Proline. Darüber hinaus haben wir fünf Glykosylierungsstellen erkannt, die typischerweise als unterschiedliche Dichten erscheinen, die aus dem Rückgrat herausragen und zu groß sind, um Aminosäureseitenketten zu entsprechen. Bei S. acidocaldarius wurde die N-verknüpfte Glykosylierung biochemisch und mittels Massenspektrometrie untersucht47. Die Glykane kommen an konservierten Konsensusstellen mit der Sequenz NXT/S vor und bestehen normalerweise aus einem dreifach verzweigten Hexasaccharid, das den ungewöhnlichen Zucker 6-Sulfoquinovose enthält47. Mithilfe der Position dieser Glykane sowie der unserer modellierten charakteristischen Aminosäuren als Fingerabdruck haben wir das Proteom von S. acidocaldarius nach Kandidatenproteinen durchsucht. Dies führte zu einem einzigen Treffer, Saci_0406 (ergänzende Abbildung 7).

Um zu bestätigen, dass Saci_0406 den Thread enthält, haben wir versucht, das saci_0406-Gen auszuschalten. Die Deletionsmutante Δsaci_0406 ergab keine Kolonien. Wir konnten jedoch einen Stamm mit doppelter Deletion Δsaci_0405/0406 produzieren. Saci_0405 ist das Gen neben Saci_0406 und wird voraussichtlich zusammen mit diesem transkribiert. Die Tatsache, dass die Δsaci_0406-Mutante keine Kolonien hervorbringt, die Δsaci_0405/0406 jedoch schon, legt nahe, dass die alleinige Expression von Saci_0405 für die Zellen toxisch sein könnte. Negativ gefärbte Elektronenmikroskopie zeigte, dass der Mutant Aap-Pili, jedoch keine Fäden zusammenbauen konnte, was unsere Strukturdaten bestätigte (ergänzende Abbildung 1f).

Mithilfe der Sequenz von Saci_0406 konnten wir eindeutig ein Atommodell für den Thread erstellen (Abb. 1b – e), ohne den N-Terminus (Met1 – Ala23). Anschließend haben wir die Struktur dieses Proteins mithilfe von Alphafold2 vorhergesagt. Die resultierende Vorhersage stimmte weitgehend mit unserer Ab-initio-Struktur überein (ergänzende Abbildung 8), was darauf hinweist, dass Saci_0406 tatsächlich die Untereinheit der Fadenfilamente bildet. Das Alphafold-Modell legte nahe, dass Met1 – Ala23 von Saci_0406 ein α-helikales Signalpeptid bildet, was vom DeepTMHMM48-Server bestätigt wurde (ergänzende Abbildung 9a, b). Die Analyse der Sequenz von Saci_0406 mit dem SignalP5-Server ergab eine Signalpeptidase-I-Verarbeitungsstelle, die nach der N-terminalen α-Helix zwischen der Position Ala23-Asp24 (AA-Sequenz: ...LVA/DV...) spaltet (ergänzende Abb. 9d)49 und erklärt das Fehlen von Met1 – Ala23 in unserer Struktur.

Unser Atommodell zeigt, dass jede Untereinheit aus einem N-terminalen β-Strang (Schwanz) besteht, gefolgt von einer kugelförmigen Domäne (Kopf). Die Kopfdomäne enthält zwei β-Faltblätter bestehend aus 11 β-Strängen (Abb. 1b). Auf der Ebene der Untereinheiten fehlt ein β-Strang, um das Blatt zu vervollständigen, sodass eine Lücke zwischen β-4 und β-12 verbleibt (ergänzende Abbildung 10). Bei genauerer Untersuchung des zusammengesetzten Filaments wird dieser fehlende Strang durch den β1-Schwanzstrang der nächsten Untereinheit entlang des Filaments (n+1) ersetzt (Abb. 1D; ergänzende Abb. 10b). Jede Kopfdomäne bildet hierbei eine hauptsächlich antiparallele Beta-Blade eines gemischten Typs, die insgesamt aus 12 Beta-Strängen besteht (ergänzende Abbildung 10). Ein solches DSC wurde zuvor sowohl bei bakteriellen CU-Pili (T1P, P-Pili) als auch bei T5P beobachtet, wo vorgeschlagen wurde, dass es zur Stabilität des Filaments beiträgt (ergänzende Abbildung 11) 35, 50. Im Faden reicht der β-Schwanz der Untereinheit n zwei Positionen entlang des Filaments weiter in die Untereinheit hinein (n – 2; Abb. 1d, ergänzende Abb. 10b). β;− 1 der Untereinheit n ist teilweise in den Untereinheiten n − 1 und n − 2 vergraben (Abb. 1d, ergänzende Abb. 16i), was die Stabilität der Wechselwirkung weiter erhöht. Darüber hinaus verbindet eine starke kontinuierliche (rückgratartige) Dichte die Carboxamid-Seitenkette, die zu Asn57 jeder Untereinheit (n) gehört, mit der α-Aminogruppe des N-terminalen Asp24 im Protomer an zwei Positionen entlang des Filaments (n + 2). . (Abb. 1c, ergänzende Abb. 12b, ergänzender Film 1). Diese kontinuierliche Dichte sowie der Abstand und die Ausrichtung der beteiligten Reste sind typisch für Isopeptidbindungen, die in SDP-Pili grampositiver Bakterien vorkommen (ergänzende Abbildung 12a) 51, 52, 53, 54. Es wurde ein Vergleich zwischen den Isopeptidbindungen von Spy0128 (Streptococcus pyogenes) und Saci_0406 durchgeführt. Bei der Bakterienart wird durch die Verbindung von Threonin 311 mit Lysin 161 in den grampositiven Pili ein Wassermolekül freigesetzt, während im Fall des Fadens ein ungewöhnliches Ammoniumion erzeugt wird (ergänzende Abbildung 12).

Entlang der Karte des S. acidocaldarius-Fadens fanden wir Sackgassenvorsprünge, die weder dem Proteinrückgrat noch den Seitenketten ähnelten. Diese Vorsprünge wurden ausschließlich an den Asparaginresten N56, N80, N83, N121 und N146 jeder Fadenuntereinheit gefunden (Abb. 1f – j). Jeder dieser Asparaginreste ist Teil einer N-Glykosylierungs-Konsensussequenz (NXS/T). Da bekannt ist, dass oberflächenexponierte Proteine in S. acidocaldarius55 stark glykosyliert sind, schlussfolgerten wir, dass diese Dichten N-Glykanen entsprechen. Die mit Asn146 assoziierte Glykandichte wurde besonders gut aufgelöst, vermutlich aufgrund seiner ungewöhnlichen parallelen Position zum Rückgrat, die wahrscheinlich seine Flexibilität verringert (Abb. 1j). Basierend auf diesen Dichten konnten wir die vollständige Sequenz der zuvor bestätigten dreifach verzweigten Hexasaccharideinheit von S. acidocaldarius56 in die filamentöse Struktur modellieren (Abb. 1f – j). Mit jeder der fünf Glykosylierungsstellen am entsprechenden Asparagin sind zwei N-Acetylglucosamin (GlcNAc)-Reste verbunden, von denen sich der zweite verzweigt, um zwei einzelne Mannose (Man), Glucose und ein 6-Sulfoquinovose-Molekül zu binden. Während Glykosylierungsstellen zuvor nur teilweise in Strukturen von crenarchaealen Pili aufgelöst wurden, ermöglichte uns unsere Karte, den vollständigen N-Glykanbaum von S. acidocaldarius über das gesamte Filament hinweg zu modellieren (Abb. 1e).

Als nächstes fragten wir, wie sich die Fadenfilamente in den in unseren 2D-Klassen beobachteten Kabeln organisieren (ergänzende Abbildung 1h). Daher haben wir diese Klassen (mit 17.813 Partikeln) ausgewählt und eine nicht-helikale 3D-Verfeinerung durchgeführt. Die resultierende Karte hat eine Auflösung von 13 Å und enthält 5 gebündelte Fadenfilamente (Abb. 2a). Die Auflösung war wahrscheinlich aufgrund der unterschiedlichen Ausrichtung verschiedener Fäden begrenzt, sodass die Polarität der Filamente im Kabel nicht eindeutig bestimmt werden konnte. Durch die Anpassung des Atommodells unseres Filaments an parallele (Abb. 2b, c) und antiparallele Ausrichtungen (Abb. 2d) stellten wir jedoch fest, dass beide Anordnungen die gleiche Formkomplementarität aufweisen. Dadurch wäre es prinzipiell möglich, die Fäden unabhängig von ihrer Polarität miteinander zu verzahnen. In beiden Szenarien scheinen die Fäden hauptsächlich über ihre Glykane zu interagieren, was darauf hindeutet, dass diese posttranslationalen Modifikationen eine wichtige Rolle bei der Kabelbildung spielen.

eine CryoEM-Karte eines Fadenkabels mit einer Auflösung von 13 Å. Atomare Modelle des Fadens (in Cartoon-Darstellung) können in paralleler (b, c) oder antiparalleler Ausrichtung (d) in die Karte eingepasst werden. Die Formkomplementarität zwischen parallelen und antiparallelen Fäden ist sehr ähnlich (c, d). Glykane (Stäbchen) vermitteln die Wechselwirkung zwischen den Fäden im Kabel. A und B haben die gleiche Ausrichtung. c und d sind gegenüber a und b um 150° gedreht. Maßstabsbalken 40 Å.

Um zu untersuchen, wie weit verbreitet Fäden in Archaeen sind, haben wir Saci_0406 gesprengt und Kandidatenproteine mit einer hohen Sequenzähnlichkeit in verschiedenen anderen Crenarchaeen gefunden. Mithilfe von SyntTax wurden mehrere orthologe Proteine identifiziert, und mithilfe von AlphaFold2 wurde festgestellt, dass eine ähnliche vorhergesagte Struktur wie die von Saci_0406 in den Genomen verschiedener Vulcanisaeta- und Acidianus-Arten kodiert ist (Abb. 3). Einige Homologe bilden einen Cluster von Orthologen (arCOG10215), der Mitglieder der crenarchaealen Phyla umfasst57. Die Vorhersage ihrer Strukturen mithilfe von Alphafold2 legt nahe, dass diese Homologen strukturell nahezu identisch mit Saci_0406 sind (mit durchschnittlichen RMSDs von 2–3 Å; Abb. 3b – e). Alle fünf Homologen folgen der gleichen Beta-Blade-Kopfstruktur wie die Thread-Untereinheit Saci_0406. Die ersten 7 Aminosäuren nach der Sec/SPI-Verarbeitungsstelle des N-terminalen Signalpeptids sind ebenfalls identisch, einschließlich des Isopeptids Asp24 und eines sehr konservierten YYY-Motivs (ergänzende Abbildung 13). Basierend auf dem konservierten Asp24 nehmen wir an, dass die vorgeschlagene Isopeptidbindung in den Thread-Homologen konserviert ist.

ein phylogenetischer Baum von Arten, in denen Saci_0406-Homologe identifiziert wurden. b Saci_0406 (lila) im Vergleich mit Alphafold2-Vorhersagen von Homologen, die in V. moutnovskia (blau) und A. hospitalis (rosa) gefunden wurden. c Die Überlagerung der Strukturen aus B zeigt ihre Ähnlichkeit. Paarweise RMSD-Werte berechnet zwischen Saci_0406 und den Fadenhomologen von V. moutnovskia (d) und A. hospitalis (e). Blau zeigt niedrige und Rot hohe Werte an. Der Durchschnittswert RMSD beträgt 2,18 Å für D und 2,63 Å für E. Maßstabsbalken 20 Å.

Anschließend analysierten wir die Syntenie von saci_0406 (ergänzende Abbildung 14). Tatsächlich scheint die genetische Nachbarschaft bei eng verwandten Arten erhalten zu bleiben. Orthologe von saci_0406 kommen zusammen mit denen von saci_0405, saci_0407 und saci_0408 vor. RNAseq-Daten58 legen nahe, dass saci_0408 und saci_0407 von einem anderen Promotor als saci_0406 und saci_0405 exprimiert werden (ergänzende Abbildung 15). Bei einigen Arten sind die zu saci_0407 und saci_0408 orthologen Gene zu einem Gen fusioniert, während es sich bei anderen offenbar um eine nichtkodierende Region handelt (ergänzende Abbildung 14b).

Wir haben die Strukturen von 0405, 0407 und 0408 mithilfe von Alphafold2 vorhergesagt (ergänzende Abbildung 15b). Während die Vorhersagen für 0407 und 0408 nicht zu schlüssigen Erkenntnissen führten, erlaubt uns die Saci_0405-Struktur, eine Rolle des Proteins beim Fadenaufbau vorzuschlagen.

Die vorhergesagte Struktur von Saci_0405 weist eine bemerkenswert ähnliche Falte wie Saci_0406 auf (ergänzende Abbildung 16a), einschließlich des verlängerten Schwanzes. Der mittlere RMSD zwischen den beiden Strukturen betrug nur 4,58 Å (ergänzende Abbildung 16b). Um festzustellen, ob sich zwischen Saci_0405 und Saci_0406 ein Komplex bilden kann, wie dies häufig zwischen Haupt- und Nebenpilinen der Fall ist, verwendeten wir Alphafold2, um beide Proteine in einem Komplex vorherzusagen, indem wir den N-terminalen Schwanz von Saci_0405 in der Donorstrang-Akzeptorstelle von platzierten Saci_0406 (Ergänzende Abbildung 16c). Die Modellierung von Saci_0405 in einer Endposition in unserer Thread-Struktur ergab, dass Saci_0405 die β1-Akzeptorstelle einer Saci_0406 n + 1-Untereinheit ergänzen könnte (ergänzende Abbildung 16h, i). Interessanterweise fehlt Saci_0405 im Gegensatz zu Saci_0406 eine Donorstrang-Akzeptorstelle in seiner globulären Domäne (ergänzende Abbildung 16d). Dieser faszinierende Befund legt nahe, dass Saci_0405 als Filamentkappe fungieren könnte. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese werden Saci_0405 und Saci_0406 sehr wahrscheinlich unter einem Promotor exprimiert (ergänzende Abbildung 15a), was auf eine Koexpression und damit auf eine funktionelle Verbindung zwischen den beiden Proteinen hinweist. Darüber hinaus zeigen die RNAseq-Daten, dass saci_0405 in geringeren Mengen und damit in geringeren Kopienzahlen als saci_0406 exprimiert wird, entsprechend einer mutmaßlichen Funktion als Obergrenze (ergänzende Abbildung 15a)58 . Cap-Proteine sind ein Kennzeichen für Bakterienfilamente, die sich durch DSC zusammensetzen. Alle diese Filamente benötigen eine terminale Untereinheit, die die terminale Schwanzdomäne abschirmt und selbst nicht auf ein anderes Protein angewiesen ist, um einen vollständigen β-Strang bereitzustellen59.

Die Gesamtarchitektur des S. acidocaldarius-Fadenfilaments erinnert an die bakteriellen Chaperon-Usher-Salmonella-atypischen Fimbrien (Saf)-Pili und den kürzlich charakterisierten P. gingivalis T5P, die sich nicht über den CU-Weg zusammensetzen (ergänzende Abbildung 11a). -D). Threads, Saf und T5P bestehen alle aus gestapelten Untereinheiten, die durch DSC des N-terminalen β-Strangs miteinander verbunden sind. Auf der Ebene der Untereinheiten gibt es jedoch kaum strukturelle Ähnlichkeit zwischen Fäden und bakteriellen Saf- und T5P-Pili.

Beim Vergleich von Fäden und bakteriellem T1P gibt es einen signifikanten strukturellen Unterschied in der allgemeinen Architektur der Filamente (ergänzende Abbildung 11a, e). Während Fäden als lineare, 40 Å breite, an einer Schnur aufgereihte Filamente beschrieben werden können, bilden T1P- und P-Pili hohle (wahrscheinlich mit Lösungsmittel gefüllte) Röhren mit Durchmessern von 60–70 Å29,61. Dies spiegelt sich in unterschiedlichen helikalen Parametern wider. Während die Fäden eine Steigung von 31,6 Å und eine Drehung von –103,2° aufweisen, haben Pili vom Typ I eine gemeldete Steigung von 7,7 Å und eine Drehung von 115°. P-Pili zeigen große Ähnlichkeit mit Werten von 7,7 Å und 109,8° für Steigung bzw. Drehung29,61. Der Pilus vom Typ V hat eine Steigung von 66,7 Å mit einer Drehung von 71°,50.

Der Vergleich der Struktur der Fadenuntereinheit Saci_0406 mit denen von bakteriellen Pilinen zeigt eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit bakteriellen T1P- und P-Pilinen von UPEC / UTI-Stämmen von E. coli (ergänzende Abbildung 11a, e). Die Überlagerung der Struktur von Saci_0406 mit denen von FimA und PapA von E. coli ergibt Gesamt-RMSD-Werte von 9,94–11,76 Å mit einem hochkonservierten β-Blade-Kern (RMSD-Werte um 2 Å; ergänzende Abbildung 17a – d). Bemerkenswert ist, dass sich T1P- und P-Pili über DSC zusammenlagern, katalysiert durch den Chaperon-Usher-Weg26,28,29,30,61. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit zwischen Saci_0406 und den bakteriellen Typ-I-Pilinen deuteten mehrere Sequenzausrichtungen auf eine geringe Sequenzhomologie hin (ergänzende Abbildung 17e). Daher nehmen wir an, dass DSC- und ß-Faltblatt-reiche kugelförmige Domänen eine konvergent entwickelte strukturelle Lösung zum Aufbau eines bemerkenswert stabilen Klebefilaments sind.

Extrazelluläre Filamente sind häufig an adhäsiven oder treibenden Prozessen beteiligt und müssen daher gegenüber mechanischen Kräften und widrigen oder sich ändernden Umweltbedingungen widerstandsfähig sein. Dies gilt insbesondere für die Fäden von S. acidocaldarius, der in Umgebungen mit stark saurem pH-Wert und Temperaturen bis zu 80 °C lebt. Fäden gewinnen wahrscheinlich durch drei von uns entdeckte Strukturanpassungen an Zugfestigkeit und Widerstandsfähigkeit gegenüber Hitze und saurem pH-Wert: DSC, die vorgeschlagenen intermolekularen kovalenten Isopeptidbindungen sowie einen hohen Glykosylierungsgrad.

DSC wurde zuvor in verschiedenen Arten von Bakterien-Pili gefunden, wie z. B. T1P, P-Pili (CU-Pili), T5P59, sowie in der erst kürzlich veröffentlichten Struktur der archaealen Bündelungs-Pili von Pyrobaculum calidifontis62. Alle diese Filamente sind an der Adhäsion oder Biofilmbildung beteiligt. Dementsprechend behielten Adhäsionsexperimente mit S.-acidocaldarius-Mutanten, denen Archaella, Aap und UV-Pili fehlten, aber dennoch Fäden exprimierten, eine Adhäsion von 25 % im Vergleich zu WT40. Darüber hinaus war dieser Mutantenstamm weiterhin in der Lage, Biofilme zu bilden und wies im Vergleich zu WT40 sogar eine höhere Dichte an durch Biofilme übertragenen Zellen auf. Wir zeigen, dass Fäden dazu neigen, sich zu Kabeln aus mehreren Filamenten auszurichten, wobei eine parallele und antiparallele Ausrichtung zwischen einzelnen Pili prinzipiell möglich ist. Diese Kabelbildung kann entweder aus einer Zelle austretende Fäden verstärken oder Verbindungen zu benachbarten Zellen herstellen. Weitere Experimente sind erforderlich, um die funktionelle Rolle von Fadenkabeln bei der Verbindung von Archaeenzellen sowie bei der Bildung von Biofilmen aufzuklären.

Fäden scheinen in der archaischen Domäne weit verbreitet zu sein, wie unser Fund von saci_0406-Homologen in verschiedenen Crenarchaeen zeigt. Mehrere Sequenz-Alignments zeigten eine konservierte SP I-Spaltungsstelle in allen Homologen (ergänzende Abbildung 13). Darüber hinaus zeigen Alphafold2-Vorhersagen von Homologen aus Acidianus hospitalis und Vulcanisaeta moutnovskia eine sehr ähnliche Faltung. Der N-terminale ß-Strang, der an der DSC beteiligt ist, ist in ähnlicher Weise konserviert, was darauf hindeutet, dass es sich um ein gemeinsames Merkmal in Crenarchaealfäden handelt.

Die Fäden scheinen durch eine nichtkanonische Isopeptidbindung zwischen Asn57 der Untereinheit n und dem N-terminalen Asp24 der Untereinheit n + 2 kovalent miteinander verbunden zu sein. Bemerkenswert ist, dass Asp24 bei allen identifizierten Homologen konserviert ist. Ähnliche Isopeptidbindungen sorgen nachweislich für zusätzliche Stabilität in Filamenten einiger grampositiver Bakterien, diese treten jedoch normalerweise zwischen Lys- und Asn/Asp-Resten auf54,63,64.

In SDP-Pili der grampositiven Spezies Actinomyces oris kommt es zu einer Isopeptidbindung zwischen Thr499 und Lys18265, und in S. pyogenes ist das C-terminale Thr311 kovalent an Lys16151 gebunden. In beiden Fällen wird die Isopeptidbindung zwischen direkt benachbarten (n und n + 1) Untereinheiten hergestellt. Im Gegensatz dazu wird die vorgeschlagene Isopeptidbindung im Faden zwischen den Untereinheiten n und n + 2 hergestellt.

In Bakterien wird die Bildung der Isopeptidbindung durch eine Sortase katalysiert. Dieses Enzym erkennt ein spezifisches Motiv in der Nähe des C-Terminus neu eingebauter Untereinheiten und spaltet den Terminus, der das Isopeptid mit einer stromaufwärts gelegenen Untereinheit verbindet65. Eine gut untersuchte archaeale Sortase ist die Archaosortase ArtA aus dem Euryarchaeon Haloferax volcanii, die für die Verankerung von ArtA-Substratproteinen auf der Zelloberfläche an der Zellmembran unerlässlich ist. Trotz ähnlicher katalytischer Reste wird keine weitere Homologie zwischen ArtA und bakteriellen Sortase-Enzymen gefunden66. Da in Crenarchaeen bisher keine Sortasen gefunden wurden, ist es wahrscheinlich, dass entweder eine noch nicht identifizierte Transpeptidase die Bildung der Isopeptidbindungen unterstützt oder dass sie sich spontan bilden. Tatsächlich wurde vorgeschlagen, dass die spontane Bildung von Isopeptidbindungen in grampositiven Bakterien wie S. pyogenes63 auftritt und bei der Entwicklung neuartiger ortsspezifischer Antikörper-Wirkstoff-Konjugate67 genutzt werden kann.

Da in den kürzlich gelösten Archaealbündel-Pili von P. calidifontis62 keine Isopeptidbindungen gemeldet wurden, könnten sie ein einzigartiges Merkmal von Fäden sein. Darüber hinaus enthält Saci_0406 im Vergleich zum archaischen Bündel-Pili keine PFAM-Domäne, die auf Caldarchaeales und eine nicht charakterisierte Abstammungslinie beschränkt zu sein scheint62. Diese Unterschiede legen nahe, dass Fäden eine eigene Klasse von Oberflächenfilamenten archaischer Zellen bilden.

Jede Fadenuntereinheit ist an fünf Asparaginresten glykosyliert. Basierend auf unserer KryoEM-Karte konnten wir die vollständige Struktur des N-Glykans von S. acidcaldarius aufbauen, das zuvor mittels Massenspektrometrie sequenziert wurde56. Bei Archaeen ist die Glykosylierung sehr vielfältig, mit einer großen Vielfalt möglicher Zuckereinheiten, die zusätzliche Modifikationen aufweisen können55.

Ein hoher Glykosylierungsgrad ist ein gemeinsames Merkmal oberflächenexponierter Archaeenproteine. Für S. acidocaldarius hat sich gezeigt, dass die Glykosylierung für die Motilität, die ordnungsgemäße Funktion der S-Schicht sowie die artspezifische Erkennung von entscheidender Bedeutung ist68,69. Darüber hinaus ist ein hoher Glykosylierungsgrad wahrscheinlich eine wichtige Anpassung an stark saure Umgebungen und trägt zur bemerkenswerten Stabilität archaischer Filamente bei, wie für die AAP von S. solfataricus und S. islandicus gezeigt 12,44. Innerhalb der Fadenkabel können die Glykane molekulare Brücken zwischen den einzelnen Fadensträngen bilden, die über intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen die Überstruktur stabilisieren. Dies unterstreicht die Bedeutung von Glykanen für die filamentvermittelte Adhäsion.

Die Struktur des Fadens lässt auf Schlüsselschritte in seiner Biogenese schließen, wie in Abb. 4 dargestellt. Die Bioinformatik weist darauf hin, dass die Fadenuntereinheit Saci_0406 über den Sec-Weg sezerniert wird. Im nächsten Schritt erkennt die archaeale Signalpeptidase I das Signalpeptid und spaltet den N-Terminus des Präproteins. Dies führt zum reifen Saci_0406-Protein mit einem N-terminalen Aspartat und einem Archaeen-spezifischen Triple-Y-Motiv nach der Spaltungsstelle70. Saci_0406 wird dann durch AglB, die Oligosacaryltransferase, glykosyliert, die das N-Glykan auf die spezifischen Asparaginsäuren innerhalb der N-Glykosylierungssequenz überträgt71.

Saci_0406-Vorläuferproteine werden zunächst über das SEC-Translokon sezerniert (1). Die Signalpeptidase 1 (SP1) spaltet das N-terminale Signalpeptid (2). Das Protein wird durch AglB (3; Glykane als schwarze Stäbchen dargestellt) glykosyliert. Lösliche, reife Saci_0406-Proteine ordnen sich durch Donorstrangkomplementierung zum Faden an (4, 5). Dieser Prozess kann spontan ablaufen oder durch eine Montagemaschinerie katalysiert werden. Es wird nicht erwartet, dass das mutmaßliche Cap-Protein Saci_0405 durch SEC sezerniert wird. Seine Position im Faden hängt von der Polarität des Filaments ab, die derzeit unbekannt ist. Wenn die Enden von Saci_0406 von der Zelle weg zeigen, bildet Saci_0405 eine zellnahe Kappe, die den Fadenaufbau abschließt (Hypothese 1). Wenn die Saci_0406-Schwänze zur Zelle zeigen, bildet Saci_0405 eine zelldistale Kappe, die den Fadenaufbau initiiert (Hypothese 2).

Das Vorhandensein von DSC und die strukturelle Ähnlichkeit mit bakteriellem T1P werfen die interessante Frage auf, ob das Fadenfilament über einen Prozess zusammengesetzt wird, der dem bakteriellen Chaperone-Usher-Weg ähnelt. Hier werden Präpiline zunächst durch das Chaperon (FimC in Typ I und PapD in P-Pili von E. coli) am entstehenden N-Terminus gebunden. Der Donorstrang des Chaperons stabilisiert die Pilin-Untereinheit, bis sie in das wachsende Pilusfilament an der Usher-Porne integriert wird59,72,73,74.

Im Gegensatz dazu werden bei T5P Vorläufer der Untereinheitsproteine an einem Cystein in einer Lipobox-Region lipidiert. Die Vorläufer werden dann zur Sekundärmembran geleitet, wahrscheinlich über den Lol-Weg, und nach der anschließenden Spaltung durch eine Arginin/Lysin-spezifische Protease wird das Filament polymerisiert38. In der kürzlich veröffentlichten Struktur des TasA-Filaments von Gram-positivem Bacillus subtilis interagieren die TasA-Untereinheiten über DSC eng miteinander und bilden ein dünnes Filament. In der Monomerform stabilisiert sich TasA durch Selbstkomplementierung der Bindungsstelle für den Donorstrang. Im Filament erfährt TasA eine Konformationsänderung und die Bindungsstelle ist für die DSC der benachbarten Untereinheit frei. Die Filamentpolymerisation wird durch ein akzessorisches Protein TapA initialisiert, das an die Strangaufnahmefurche von TasA binden kann, sodass TasA die Bindung an die nächste Untereinheit initiieren kann75. Die Strukturvorhersage der archaealen Bündel-Pili-Untereinheit ergab einen ähnlichen Mechanismus und tatsächlich beobachteten wir in einigen unserer Alphafold-Vorhersagen für Saci_0406 auch eine automatische Komplementierung (ergänzende Abbildung 16f, g).

Die Analyse des Genclusters rund um Saci_0406 ergab keine Proteine, die definitiv entweder einem Chaperon oder einem Usher-Protein zugeordnet werden könnten. Dementsprechend besitzen S. acidocaldarius und tatsächlich die meisten bekannten Archaeen keine äußere Membran, was darauf hindeutet, dass ein Usher-Protein möglicherweise nicht erforderlich ist. Stattdessen sind viele Archaeen, darunter auch S. acidocaldarius, von einer proteinhaltigen und hochporösen Zellwand umgeben, die als S-Schicht bezeichnet wird76. Die S-Schicht von S. acidocaldarius enthält dreieckige und sechseckige Poren mit angegebenen Durchmessern von ∼45 Å bzw. ∼80 Å77. Mit einem Durchmesser von 40 Å würden Fäden bequem durch die 80 Å große sechseckige Pore passen, die somit als Kanal für den Faden an der Zelloberfläche dienen könnte. Dementsprechend wurde bereits zuvor gezeigt, dass S-Schichten an der Verankerung von Archaella beteiligt sind78.

Saci_0405 hat eine ähnliche Faltung wie Saci_0406 mit einem N-terminalen ß-Strang, aber keiner Donorstrang-Akzeptorstelle. Dies bedeutet, dass Saci_0405 in der Lage wäre, seinen ß-Strang für ein nachgeschaltetes Saci_0406-Molekül bereitzustellen, ohne selbst einen komplementären ß-Strang zu benötigen. Ob Saci_0405 eine zellproximale oder zelldistale Kappe bildet, hängt von der Polarität des Fadenfilaments ab, die bisher unbekannt ist (Abb. 4). Wenn die Saci_0406-Schwänze von der Zelle weg zeigen (wie es bei bakteriellem T1P, P-Pili und T5P der Fall ist), würde Saci_0405 eine zellnahe Kappe bilden. In diesem Fall würde Saci_0405 die Thread-Assembly beenden (Abb. 4, Hypothese 1). Im alternativen Szenario zeigen die Saci_0406-Schwänze in Richtung der Zelle (Abb. 4, Hypothese 2). Hier fungiert Saci_0405 als keimbildende Untereinheit, die den Fadenaufbau einleitet und sich nach außen bewegt, wenn neue Saci_0406-Untereinheiten am unteren Ende des wachsenden Filaments hinzugefügt werden. In diesem Modell würde Saci_0405 eine ähnliche Rolle wie TapA spielen, das bei der Keimbildung des von B. subtilis gebildeten TasA-Filaments hilft. Eine ähnliche Rolle wurde für AbpA im kürzlich charakterisierten Archaeal-Bündel Pili vorgeschlagen62,75. Interessanterweise weist das mutmaßliche Cap-Protein Saci_0405 im Gegensatz zu Saci_0406 keine vorhergesagte Sec-Signalsequenz auf (ergänzende Abbildung 9e). DeepTMHMM48 sagt jedoch eine extrazelluläre Lokalisierung voraus (ergänzende Abbildung 9c). Dies deutet darauf hin, dass Saci_0405 über einen noch zu identifizierenden Mechanismus, möglicherweise über einen Membrankanal in der Fadenmontagemaschinerie, in das Pseudoperiplasma exportiert werden könnte.

Zusammenfassend schlagen wir vor, dass Archaeenfäden eine neue Klasse von Archaeen-Biofilm-bildenden Proteinfilamenten umfassen, die unabhängig von ähnlichen Bakterienpili entstanden sind. Die Fäden werden auf einem noch unbekannten Weg zusammengefügt, wobei wahrscheinlich die Komplementierung des Spenderstrangs die treibende Kraft liefert. Um mehr Licht auf die Biogenese der Fäden zu werfen, wird die Identifizierung und Charakterisierung der Montagemaschinerie von größter Bedeutung sein.

S. acidocaldarius MW158 (ΔupsEΔarlJ) oder MW114 (ΔpibD) wurden aus Kryostock in 6 × 5 ml Basal-Brock (pH 3), ergänzt mit 0,1 % NZ-Amin, 0,2 % Dextrin und 10 µg/ml Uracil, inokuliert. Die Zellen wurden zwei Tage lang bei 75 °C unter leichtem Rühren gezüchtet. Pro Liter Hauptkultur wurden 5 ml Vorkultur angeimpft. Die Zellen wurden 48 Stunden lang gezüchtet, bis sie eine OD600 nm = 1 erreichten. Anschließend wurden die Zellen mit 5000 × g für 25 Minuten bei 4 °C geerntet. Die Zellpellets aus der 2-Liter-Hauptkultur wurden in 20 ml Basal Brock (pH 3) ohne FeCl3 resuspendiert. Zum Abscheren der Fäden erfolgte entweder das Abscheren wie bei Henche et al.79 beschrieben oder es wurde eine peristaltische Pumpe (Gilson Minipuls) verwendet, die mit einer Spritzennadel mit 1,10 mm Durchmesser und 40–50 mm Länge (Braun GmbH) verbunden war. Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei 25 U/min homogenisiert. Die Spritzennadel wurde auf schmalere mit 0,45 mm Durchmesser und 10 mm Durchmesser umgestellt und die Scherung erfolgte 1 Stunde lang bei 25 U/min. Anschließend wurde die gescherte Probe 25 Minuten lang bei 4 ° C und 12.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde einer Ultrazentrifugation bei 200.000 × g für 90 Minuten und 4 ° C unterzogen. Das resultierende Pellet wurde in 500 µL Basal Brock ohne FeCl3 resuspendiert und auf 4,5 ml CsCl2 (0,5 g/ml) geschichtet und einer Dichtegradientenzentrifugation bei 250.000 × g für 16 Stunden bei 4 °C unterzogen. Im oberen Drittel des Röhrchens wurde eine weiße Bande entdeckt und gesammelt. Dies wurde in Basal Brock ohne FeCl3 auf 5 ml verdünnt und 1 Stunde lang bei 4 °C bei 250.000 × g pelletiert. Das Pellet wurde in 150 µL Citratpuffer (25 mM Natriumcitrat/Zitronensäure, 150 mM NaCl, pH 3) resuspendiert und bei 4 °C gelagert.

Deletionsplasmide für S. acidocaldarius wurden durch Amplifikation der stromaufwärts und stromabwärts gelegenen flankierenden Region der interessierenden Gene (400–600 bp) unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Primer konstruiert. Eine Überlappungs-PCR wurde durchgeführt, um stromaufwärts und stromabwärts gelegene Fragmente und die verbundenen Fragmente zu verbinden Das Fragment wurde in pSVA406 kloniert, das die pyrEF-Kassette von S. solfataricus enthielt, was zu dem in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Plasmid führte. Das Plasmid wurde durch Transformation in E. coli ER 1821, das pM.EsaBC4I80 enthielt, methyliert. Die Transformation des Plasmids in S. acidocaldarius und die Erzeugung der Deletionsmutante erfolgte wie zuvor beschrieben81. Die Deletion wurde durch PCR und DNA-Sequenzierung bestätigt. Der Deletionsstamm ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

5 µl Zellen wurden auf frisch entladene, mit Kohlenstoff beschichtete 300-Mesh-Kupfergitter (Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland) aufgetragen und 30 s lang inkubiert. Die überschüssige Flüssigkeit wurde abgetupft und die Gitter wurden mit 2 % Uranylacetat gefärbt. Die Bildgebung erfolgte entweder mit einem Zeiss Leo 912 Omega (Wolfram) (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland), betrieben bei 80 kV, ausgestattet mit einem Dual Speed 2K-On-Axis Charged Coupled Device (CCD) Sharp-Eye (TRS Systems, Moorenweis, Deutschland) Kamera, ein Hitachi HT8600, betrieben bei 100 kV, ausgestattet mit EMSIS , USA).

Ein 3-μl-Tropfen einer Suspension, die eine Mischung aus Aap-Pili und Fäden enthielt, wurde auf glimmentladene 300-Mesh-Kupfer-R2/2-Quantifoil-Gitter aufgetragen. Die Gitter wurden mit 597 Whatman-Filterpapier 5 s lang mit einer Blotkraft von -1 bei 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 21 °C geblottet und mit einem Mark IV Vitrobot (FEI) in flüssigem Ethan tauchgefroren. Das Screening der Gitter erfolgte mit einem 120-kV-FEI-Technai-Spirit, ausgestattet mit einem Gatan OneView CMOS-Detektor (Gatan, Pleasanton, USA). Hochauflösende Bilddaten wurden mit einem FEI Titan Krios-Elektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific, Eindhoven, Niederlande) gesammelt, das bei 300 kV im Nanosondenmodus mit paralleler Beleuchtung und komafreier Ausrichtung auf einem Gatan K2 Summit-Elektronendetektor (Gatan, Pleasanton, USA) im Zählmodus bei einer kalibrierten Vergrößerung von ×134.048 (entsprechend einer Pixelgröße von 1,047 Å auf Probenebene) mit einem Defokusbereich von –2,0 bis –3,5 µm in Schritten von 0,3 µm. Das Mikroskop und die Kamera wurden mit der EPU-Software (Thermo Fisher Scientific) gesteuert. Die Bilder wurden als Filme mit einer Dosisleistung von 0,77 e/Å2 s−1 bei 40 Bildern s−1, 10 s Belichtungszeit und einer akkumulierten Gesamtdosis von 42,33 e/Å2 aufgezeichnet. Kryo-EM-Statistiken sind in Tabelle 1 dargestellt.

Bilder aus 6272 Filmen wurden mithilfe der Vollbild-Bewegungskorrektur als Teil des cryoSPARC42-Pakets ausgerichtet, um Bühnendrift zu korrigieren. Anschließend wurde die Patch-CTF-Schätzung verwendet, um die Defokusvariation abzuschätzen. Das e2helixboxer-Programm von EMAN282 wurde verwendet, um Filamente manuell auszuwählen, sodass 2D-Klassen schnell in Relion83 generiert werden konnten. Von hier aus wurden die 2D-Klassen in cryoSPARC42 importiert, wo das Filament-Tracer-Programm 2.243.141 Filamentfragmente heraussuchte, darunter auch beide AAP-Filamente als Threads. Aus den mikroskopischen Aufnahmen wurden Partikelkoordinaten mit einer Kastengröße von 512 × 512 Pixeln extrahiert, die 10–11 Thread-Untereinheiten innerhalb einer kreisförmigen Maske abdecken. 5 Runden der 2D-Klassifizierung mit jeweils 50 Klassen trennten die Aap-Pili von den Threads, was zu einer Gesamtzahl von 188.620 Partikeln aus den besten Klassen führte. Mit Helix Refine wurde ein unverzerrtes 3D-Volumen erstellt, das dann untersucht werden konnte, um die Helixparameter zu bestimmen. Mithilfe von Chimera84 zur Visualisierung des Filaments mit einer Auflösung von 7,79 Å wurde ein Anstieg von etwa 90 Å im realen Raum vorhergesagt. Dies wurde dann mithilfe des Symmetriesuchprogramms in cryoSPARC42 bestätigt, das einen Anstiegsbereich von 80–120 Å und einen Verdrehungsbereich von –180° bis +180° spezifizierte. Es wurde ein scharfer Peak mit einem Anstieg von ∼95 Å und einem Verdrehungswert von ∼40° gefunden, der zur Verfeinerung der nicht voreingenommenen Helix-Verfeinerung verwendet wurde, was zu einer Karte mit einer Auflösung von 4,3 Å führte. Eine genauere Betrachtung dieses Volumens ergab, dass die oben genannten Parameter nicht einer, sondern drei sich wiederholenden Untereinheiten entsprachen. Anschließend wurde erneut eine Symmetriesuche in cryoSPARC42 unter Verwendung dieser 4,3-Å-Karte durchgeführt, um die endgültigen Parameter von −103° bzw. 31,6 Å für Drehung und Anstieg zu ermitteln. Von hier aus wurde der iterative Prozess der Durchführung einer lokalen Bewegungskorrektur, einer lokalen CTF-Verfeinerung und einer globalen CTF-Verfeinerung gefolgt von einer Helix-Verfeinerung durchgeführt, bis die Auflösung unserer Karte 3,46 Å erreichte. Die Auflösung wurde anhand einer Gold-Standard-Fourier-Shell-Korrelation zwischen zwei unabhängig verfeinerten halben Datensätzen unter Verwendung des 0,143-Kriteriums geschätzt. Diese endgültige Karte wurde dann mit DeepEMhancer85 entrauscht und nachbearbeitet. Die lokale Auflösung wurde mit der lokalen Auflösungsschätzung in cryoSPARC42 berechnet und in ChimeraX86 angezeigt (ergänzende Abbildung 5). Die Karte der Fadenkabel wurde mithilfe einer homogenen (nicht helikalen) Verfeinerung in CryoSPARC aus ausgewählten 2D-Klassen erstellt, die 17.813 Abschnitte gebündelter Filamente enthielten.

Mithilfe von Coot87 wurde ein Polyalaninmodell in die beobachtete Dichte eingebaut. Für einzigartig geformte aromatische Reste, Prolinreste und Glycinreste niedriger Dichte wurden Seitenkettenidentitäten zugewiesen. Es wird vorhergesagt, dass es sich bei den Glykosylierungsstellen in Sulfolobus acidocaldarius um N-Glykosylierungen handelt, weshalb solche Stellen als Asn x Ser/Thr-Motive bezeichnet wurden. „X“-Reste wurden als Alanine oder Serine modelliert. Mittelgroße Rückstände, die in die Beta-Fass-Kopfstruktur zeigen, wurden als aliphatisches Leucin, Isoleucin oder Valin modelliert. Kurze Oberflächenreste wurden als Asparagin, Serin oder Aspartat modelliert. Die resultierende mutmaßliche Aminosäuresequenz wurde durch die PSI-BLAST-Suche88 gegen das S.-Acidocaladarius-Genom auf dem NCBI-BLAST-Server89 laufen gelassen. Das einzige Protein, das dem Suchmuster mit einem hohen E-Wert von 5e−17 (28 % Sequenzidentität über 62 % der Länge) entsprach, war Saci_0406. Die Sequenz von Saci_0406 konnte anschließend eindeutig in unsere Karte modelliert werden. Als ungewöhnliches Brückenmerkmal erwies sich eine Isopeptidverbindung, die zwischen dem Hauptkettenstickstoff des N-terminalen Asp24 gebildet wurde, wie vom SignalP-5.0-Server49 vorhergesagt, und der Seitenkette von Asn57 aus der N-2-Kette im Filament. Um unser Modell zu bestätigen, haben wir die Struktur von Saci_0406 in AlphaFold290 vorhergesagt, was zu einer nahezu präzisen Übereinstimmung für die Kopfdomäne führte (ergänzende Abbildung 8). Die verbleibenden Monomere im Filament wurden durch phasenweisen molekularen Austausch in der Dichte positioniert, der in MOLREP91 implementiert wurde, das für EM angepasst wurde. Später wurde das CCP492-Skript erstellt, um Änderungen im neu aufgebauten Monomer an andere im Filament weiterzugeben. Die Glykanstrukturen wurden mit Coot87 modelliert, Wörterbücher für Isopeptidverknüpfungen und ungewöhnliche Zucker wurden mit JLIGAND93 erstellt. Die Struktur wurde mit REFMAC594 in der cccem-Schnittstelle verfeinert.

Das Genom von S. acidocaldarius wurde mit mehreren Werkzeugen sichtbar gemacht. Mithilfe der KEGG-Genomdatenbank95 konnten wir genau bestimmen, welche Proteine rund um Saci_0406 wahrscheinlich Teil desselben Operons waren. Syntax96 wurde verwendet, um nach der Saci_0406-Sequenz zu suchen, um die entsprechenden Genome in anderen Archaeenarten zu sehen und nach homologen Genclustern zu suchen. Aus diesen Quellen schlossen wir, dass Saci_0404 – Saci_0409 wahrscheinlich innerhalb desselben Genclusters liegen. Alphafold290 wurde verwendet, um die Strukturen der Saci-Proteine 0404–0409 mithilfe des Online-Tools ColabFold97 vorherzusagen. Die Ergebnisse wurden in Chimera84 und ChimeraX86 beobachtet, um festzustellen, ob Beziehungen zwischen den verschiedenen Proteinmitgliedern festgestellt werden konnten. PDBefold98 sowie Vorhersagen anderer mithilfe von Syntax gefundener Archaeenproteine wurden wie oben angegeben beobachtet. Die Sequenzanalyse wurde mit Clustal Omega99 durchgeführt, um Sequenzähnlichkeiten zu beobachten.

Zwei iterative PSI-BLAST88-Suchen wurden unter Verwendung der Sequenz von Saci_0406 durchgeführt, um über die größte Sequenzabdeckung hinweg die größte prozentuale Identität für fremde Arten zu bestimmen. Die fünf am stärksten abweichenden Ergebnisse wurden dann mithilfe von Clustal Omega99 strukturell miteinander verglichen.

Bereits veröffentlichte Filamente wurden auf strukturelle Ähnlichkeit mit den Fäden untersucht. P. gingivalis FimA1 und S. enterica Saf Pilus zeigen beide DSC, ähnlich wie die Fäden. Die Strukturen wurden mit USFC Chimera84 visualisiert und verglichen. Mehrere Pili von E. coli Typ I wurden ebenfalls untersucht, um die Ähnlichkeiten zwischen den Monomeren und den Fäden hervorzuheben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Atomkoordinaten- und Elektronendichtekartendaten wurden in der Proteindatenbank unter dem Zugangscode 7PNB hinterlegt. Die in dieser Studie verwendeten verarbeiteten Kartendaten sind in der EM DataResource-Datenbank unter dem Zugangscode EMDB–13546 verfügbar. Auf das in dieser Studie analysierte Genom von S. acidocaldarius (DSM639) kann über den KEGG-Zugangscode T00251 oder den NCBI-Genbankcode CP000077100 zugegriffen werden. Die in dieser Studie analysierten Transkriptomikdaten können in der Pan Genomic Database for Genomic Elements Toxic To Bacteria unter diesem Link abgerufen werden58.

Kline, KA, Dodson, KW, Caparon, MG & Hultgren, SJ Eine Geschichte von zwei Pili: Aufbau und Funktion von Pili in Bakterien. Trends Mikrobiol. 18, 224–232 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sauer, FG, Mulvey, MA, Schilling, JD, Martinez, JJ & Hultgren, SJ Bakterielle Pili: molekulare Mechanismen der Pathogenese. Curr. Meinung. Mikrobiol. 3, 65–72 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Craig, L. & Li, J. Typ IV Pili: Paradoxien in Form und Funktion. Curr. Meinung. Struktur. Biol. 18, 267–277 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lukaszczyk, M., Pradhan, B. & Remaut, H. Die Biosynthese und Strukturen bakterieller Pili. Unterzelle. Biochem 92, 369–413 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bhat, AH, Nguyen, MT, Das, A. & Ton-That, H. Verankerung von Oberflächenproteinen an der bakteriellen Zellwand durch Sortase-Enzyme: Wie es begann und was wir jetzt wissen. Curr. Meinung. Mikrobiol. 60, 73–79 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Susmitha, A., Bajaj, H. & Madhavan Nampoothiri, K. Die unterschiedlichen Rollen der Sortase in der Biologie grampositiver Bakterien. Cell Surf. 7, 100055 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garnett, JA & Atherton, J. Strukturbestimmung von Mikrotubuli und Pili: vergangene, gegenwärtige und zukünftige Richtungen. Vorderseite. Mol. Biowissenschaften. 8, 830304 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Singh, PK, Little, J. & Donnenberg, MS Bedeutende Entdeckungen und jüngste Fortschritte in der Typ-IV-Pilus-Forschung. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. https://doi.org/10.1128/MMBR.00076-22. (2022).

Christie, PJ Das reiche Spektrum bakterieller Proteintranslokationssysteme. Protein J. 38, 389–408 (2019). 2019 38:4.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elpers, L. & Hensel, M. Expression und funktionelle Charakterisierung verschiedener Chaperon-Usher-Fimbrien, Curli-Fimbrien und Typ-4-Pili von enterohämorrhagischem Escherichia coli O157:H7 Sakai. Vorderseite. Mikrobiol. 11, 378 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hospenthal, MK & Waksman, G. Die bemerkenswerten biomechanischen Eigenschaften des Typ-1-Chaperon-Usher-Pilus: eine strukturelle und molekulare Perspektive. Mikrobiol. Spectr. 7 (2019).

Wang, F. et al. Die Strukturen zweier archaeischer Typ-IV-Pili beleuchten evolutionäre Zusammenhänge. Nat. Komm. 11, 1–10 (2020).

Google Scholar

Albers, SV & Jarrell, KF Das Archaellum: ein Update zur einzigartigen archaischen Motilitätsstruktur. Trends Mikrobiol. 26, 351–362 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chaudhury, P., Quax, TEF & Albers, SV Vielseitige Zelloberflächenstrukturen von Archaeen. Mol. Mikrobiol. 107, 298–311 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

van Wolferen, M., Orell, A. & Albers, SV Archaeale Biofilmbildung. Nat. Rev. Microbiol. 16, 699–713 (2018). 2018 16:11.

Artikel PubMed Google Scholar

Russo, DA & Zedler, JAZ Genomische Einblicke in Proteintranslokationssysteme von Cyanobakterien. Biol. Chem. 402, 39–54 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Friedrich, C., Bulyha, I. & Søgaard-Andersen, L. Outside-in-Assemblierungsweg des Typ-IV-Pilus-Systems in Myxococcus xanthus. J. Bakteriol. Rev. 196, 378–390 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Neuhaus, A. et al. Die Kryo-Elektronenmikroskopie zeigt zwei unterschiedliche Typ-IV-Pili, die von demselben Bakterium gebildet wurden. Nat. Komm. 11, 2231 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Denise, R., Abby, SS & Rocha, EPC Diversifizierung der Typ-IV-Filament-Superfamilie in Maschinen für Adhäsion, Proteinsekretion, DNA-Aufnahme und Motilität. PLoS Biol. 17, e3000390 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Makarova, KS, Koonin, EV & Albers, SV Diversität und Entwicklung von Pili-Systemen vom Typ IV in Archaeen. Vorderseite. Mikrobiol. 7, 667 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, F., Cvirkaite-Krupovic, V., Krupovic, M. & Egelman, EH Archaeale Bündelungspfilien von Pyrobaculum cadifontis zeigen Ähnlichkeiten zwischen archaealen und bakteriellen Biofilmen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 119, e2207037119 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Connell, H. et al. Die Fimbrienexpression vom Typ 1 erhöht die Virulenz von Escherichia coli für den Harntrakt. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 93, 9827–9832 (1996).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Melville, S. & Craig, L. Pili vom Typ IV in grampositiven Bakterien. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. 77, 323–341 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Korea, CG, Ghigo, JM & Beloin, C. Die süße Verbindung: Lösung des Rätsels um mehrere zuckerbindende Fimbrienadhäsine in Escherichia coli: Mehrere E. coli-Fimbrien bilden ein vielseitiges Arsenal zuckerbindender Lektine, die möglicherweise an der Oberflächenbesiedlung beteiligt sind und Gewebetropismus. Bioessays 33, 300–311 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sarowska, J. et al. Virulenzfaktoren, Prävalenz und mögliche Übertragung extraintestinaler pathogener Escherichia coli, isoliert aus verschiedenen Quellen: aktuelle Berichte. Darm Pathog. 11, 10 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Du, M. et al. Prozessive Dynamik der Usher-Montageplattform während der uropathogenen Escherichia coli P Pilus-Biogenese. Nat. Komm. 12, 5207 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zyla, D., Echeverria, B. & Glockshuber, R. Die Donorstrangsequenz und nicht die Donorstrangorientierung bestimmt die Stabilität und Nichtgleichgewichtsfaltung der Typ-1-Pilus-Untereinheit FimA. J. Biol. Chem. 295, 12437–12448 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alonso-Caballero, A. et al. Mechanische Architektur und Faltung von E. coli-Typ-1-Pilusdomänen. Nat. Komm. 9, 2758 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hospenthal, MK et al. Die kryoelektronenmikroskopische Struktur des Typ-1-Chaperon-Usher-Pilusstabs. Struktur 25, 1829–1838.e4 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Omattage, NS et al. Strukturelle Basis für die Usher-Aktivierung und den intramolekularen Untereinheitentransfer in der P-Pilus-Biogenese in Escherichia coli. Nat. Mikrobiol. 3, 1362–1368 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Puorger, C., Vetsch, M., Wider, G. & Glockshuber, R. Struktur, Faltung und Stabilität von FimA, der Hauptstrukturuntereinheit von Typ-1-Pili aus uropathogenen Escherichia coli-Stämmen. J. Mol. Biol. 412, 520–535 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Capitani, G., Eidam, O., Glockshuber, R. & Grütter, MG Strukturelle und funktionelle Einblicke in den Aufbau von Typ-1-Pili aus Escherichia coli. Mikroben infizieren. 8, 2284–2290 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Geibel, S. & Waksman, G. Die molekulare Zerlegung des Chaperon-Usher-Signalwegs. Biochim. Biophys. Acta 1843, 1559–1567 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hasegawa, Y. et al. Lokalisierung und Funktion des akzessorischen Proteins Mfa3 in Porphyromonas gingivalis Mfa1-Fimbrien. Mol. Oral. Mikrobiol. 28, 467–480 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Salih, O., Remaut, H., Waksman, G. & Orlova, EV Strukturanalyse des Saf Pilus mittels Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitung. J. Mol. Biol. 379, 174–187 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Remaut, H. et al. Der Donor-Strang-Austausch bei der Chaperon-unterstützten Pilus-Assemblierung erfolgt über einen konzertierten β-Strang-Verdrängungsmechanismus. Mol. Zelle 22, 831–842 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ton-That, H. & Schneewind, O. Zusammenbau von Pili in grampositiven Bakterien. Trends Mikrobiol. 12, 228–234 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shoji, M., Shibata, S., Sueyoshi, T., Naito, M. & Nakayama, K. Biogenese von Typ-V-Pili. Mikrobiol. Immunol. 64, 643–656 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brock, TD, Brock, KM, Belly, RT & Weiss, RL Sulfolobus: eine neue Gattung schwefeloxidierender Bakterien, die bei niedrigem pH-Wert und hohen Temperaturen leben. Bogen. Mikrobiol. 84, 54–68 (1972).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Henche, AL, Koerdt, A., Ghosh, A. & Albers, SV Einfluss von Zelloberflächenstrukturen auf die Crenarchaeal-Biofilmbildung unter Verwendung eines thermostabilen grün fluoreszierenden Proteins. Umgebung. Mikrobiol. 14, 779–793 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Henche, AL, van Wolferen, M., Ghosh, A. & Albers, SV Analyse der wichtigsten Determinanten der Spaltungsaktivität in Signalpeptidase III (SPaseIII) PibD. Extremophile. 18, 905–913 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ & Brubaker, MA cryoSPARC: Algorithmen für die schnelle unbeaufsichtigte Kryo-EM-Strukturbestimmung. Nat. Methoden 14, 290–296 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Desfosses, A., Ciuffa, R., Gutsche, I. & Sachse, C. SPRING – ein Bildverarbeitungspaket für die helikale Rekonstruktion auf Einzelpartikelbasis aus elektronenkryomikroskopischen Aufnahmen. J. Struktur. Biol. 185, 15–26 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, F. et al. Ein weitgehend glykosylierter Archaealpilus übersteht extreme Bedingungen. Nat. Microbiol 4, 1401–1410 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Egelman, EH et al. Strukturelle Plastizität helikaler Nanoröhren basierend auf Coiled-Coil-Anordnungen. Struktur 23, 280–289 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kolappan, S., Tracy, EN, Bakaletz, LO, Munson, RS & Craig, L. Expression, Reinigung, Kristallisation und vorläufige kristallographische Analyse von PilA aus dem nicht typisierbaren Haemophilus influenzae Typ IV-Pilus. Acta Crystallogr Sekte. F. Struktur. Biol. Kristall. Komm. 68, 284–287 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zähringer, U., Moll, H., Hettmann, T., Kirel, YA & Schäfer G. Cytochrom b558/566 aus dem Archäon Sulfolobus acidocaldarius hat eine einzigartige Asn-verknüpfte, hochverzweigte Hexasaccharidkette, die 6-Sulfoquinovose enthält. EUR. J. Biochem. 267, 4144–4149 (2000).

Artikel Google Scholar

Hallgren, J. et al. DeepTMHMM sagt Alpha- und Beta-Transmembranproteine mithilfe tiefer neuronaler Netze voraus. Vorabdruck bei bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.04.08.487609 (2022).

Almagro Armenteros, JJ et al. SignalP 5.0 verbessert Signalpeptidvorhersagen mithilfe tiefer neuronaler Netze. Nat. Biotechnologie. 37, 420–423 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shibata, S. et al. Die Struktur des polymerisierten Typ-V-Pilins enthüllt den Aufbaumechanismus, der einen Protease-vermittelten Strangaustausch beinhaltet. Nat. Mikrobiol. 5, 830–837 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hae, JK, Coulibaly, F., Clow, F., Proft, T. & Baker, EN Stabilisierende Isopeptidbindungen in der Pilusstruktur grampositiver Bakterien entdeckt. Wissenschaft 318, 1625–1628 (2007). 1979.

Artikel Google Scholar

Hae, JK, Paterson, NG, Gaspar, AH, Hung, TT & Baker, EN Der Schaftpilin SpaA von Corynebacterium diphtheriae besteht aus Tandem-Ig-ähnlichen Modulen mit stabilisierenden Isopeptid- und Disulfidbindungen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 106, 16967–16971 (2009).

Artikel Google Scholar

el Mortaji, L. et al. Das Hauptpilin RrgB aus Streptococcus pneumoniae in voller Länge kristallisiert in einer faserähnlichen Struktur, die die D1-Isopeptidbindung darstellt und Details zum Mechanismus der Piluspolymerisation liefert. Biochem. J. 441, 833–843 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hendrickx, APA et al. Isopeptidbindungen des Hauptpilinproteins BcpA beeinflussen die Pilusstruktur und die Bündelbildung auf der Oberfläche von Bacillus cereus. Mol. Mikrobiol. 85, 152–163 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meyer, BH & Albers, S.-V. Scharf und süß: Proteinglykosylierung in Crenarchaeota. Biochem. Soc. Trans. 41, 384–392 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Peyfoon, E. et al. Das S-Schicht-Glykoprotein des Crenarchaeoten Sulfolobus acidocaldarius ist an mehreren Stellen mit Chitobiose-verknüpften N-Glykanen glykosyliert. Archaea 2010, 754101 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Huerta-Cepas, J. et al. eggNOG 5.0: eine hierarchische, funktionell und phylogenetisch annotierte Orthologie-Ressource basierend auf 5090 Organismen und 2502 Viren. Nukleinsäuren Res. 47, D309–D314 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wurtzel, O. et al. Eine Karte mit Einzelbasenauflösung eines archaealen Transkriptoms. Genomres. 20, 133–141 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hospenthal, MK, Costa, TRD & Waksman, G. Ein umfassender Leitfaden zur Pilus-Biogenese bei gramnegativen Bakterien. Nat. Rev. Microbiol. 15, 365–379 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zeng, L., Zhang, L., Wang, P. & Meng, G. Strukturelle Grundlagen der Wirtserkennung und Biofilmbildung durch Salmonella Saf pili. Leben 6, e28619 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hospenthal, MK et al. Die Struktur eines Chaperon-Usher-Pilus enthüllt die molekulare Grundlage des Abwickelns von Stäben. Zelle 164, 269–278 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kang, HJ & Baker, EN Intramolekulare Isopeptidbindungen verleihen dem Hauptprotein Pilin von Streptococcus pyogenes thermodynamische und proteolytische Stabilität. J. Biol. Chem. 284, 20729–20737 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hagan, RM et al. NMR-spektroskopische und theoretische Analyse einer spontan gebildeten Lys-Asp-Isopeptidbindung. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 8421–8425 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Persson, K., Esberg, A., Claesson, R. & Strömberg, N. Das Pilin-Protein FimP aus Actinomyces oris: Kristallstruktur- und Sequenzanalysen. PLoS ONE 7 (2012).

Abdul Halim, MF et al. Haloferax volcanii-Archaeosortase ist für die Beweglichkeit, Paarung und C-terminale Verarbeitung des S-Schicht-Glykoproteins erforderlich. Mol. Mikrobiol. 88, 1164–1175 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Siegmund, V. et al. Spontane Bildung von Isopeptidbindungen als leistungsstarkes Werkzeug zur Entwicklung ortsspezifischer Antikörper-Wirkstoff-Konjugate. Wissenschaft. Rep. 6, 1–9 (2016). 2016 6:1.

Artikel Google Scholar

Meyer, BH, Birich, A. & Albers, SV Die N-Glykosylierung des Archaellum-Filaments ist für den Zusammenbau und die Beweglichkeit der Archaella nicht wichtig, obwohl die N-Glykosylierung für die Beweglichkeit bei Sulfolobus acidocaldarius essentiell ist. Biochimie 118, 294–301 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

van Wolferen, M. et al. Artenspezifische Erkennung von Sulfolobales, vermittelt durch UV-induzierbare Pili- und S-Schicht-Glykosylierungsmuster. mBio 11 (2020).

Nielsen, H., Brunak, S. & Von Heijne, G. Ansätze des maschinellen Lernens zur Vorhersage von Signalpeptiden und anderen Proteinsortierungssignalen. Protein Eng. Des. Auswahl 12, 3–9 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Meyer, BH & Albers, S.-V. AglB katalysiert den Oligosaccharyltransferase-Schritt des archaealen N-Glykosylierungsprozesses und ist im thermoacidophilen Crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius essentiell. Microbiologyopen 3, 531–543 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vetsch, M. et al. Pilus-Chaperone stellen einen neuen Typ von Proteinfaltungskatalysatoren dar. Natur 431, 329–333 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sauer, FG et al. Strukturelle Grundlagen der Chaperonfunktion und der Pilusbiogenese. Science 285, 1058–1061 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sauer, FG, Pinkner, JS, Waksman, G. & Hultgren, SJ Das Chaperon-Priming von Pilus-Untereinheiten erleichtert einen topologischen Übergang, der die Faserbildung vorantreibt. Zelle 111, 543–551 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Böhning, J. et al. Molekulare Architektur des TasA-Biofilmgerüsts in Bacillus subtilis. Vorabdruck bei bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.03.14.484220 (2022).

Albers, S.-VV & Meyer, BH Die archaische Zellhülle. Nat. Rev. Microbiol 9, 414–426 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gambelli, L. et al. Architektur und modularer Aufbau von Sulfolobus-S-Schichten durch Elektronenkryotomographie entdeckt. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 116, 25278–25286 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsai, C.-L. et al. Die Struktur des periplasmatischen FlaG-FlaF-Komplexes und seine wesentliche Rolle für die Schwimmmotilität der Archaella. Nat. Microbiol 5, 216–225 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Henche, AL et al. Struktur und Funktion des adhäsiven Pilus Typ IV von Sulfolobus acidocaldarius. Umgebung. Mikrobiol. 14, 3188–3202 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kurosawa, N. & Grogan, DW Homologe Rekombination exogener DNA mit dem Sulfolobus-Acidocaldarius-Genom: Eigenschaften und Verwendungen. FEMS Mikrobiol. Lette. 253, 141–149 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wagner, M. et al. Vielseitige genetische Werkzeugkiste für den Crenarchaeoten Sulfolobus acidocaldarius. Vordere Mikrobiol. 3, 214 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, G. et al. EMAN2: eine erweiterbare Bildverarbeitungssuite für die Elektronenmikroskopie. J. Struktur. Biol. 157, 38–46 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zivanov, J. et al. Neue Werkzeuge zur automatisierten hochauflösenden Kryo-EM-Strukturbestimmung in RELION-3. Elife 7, e42166 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera – ein Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse. J. Comput. Chem. 25, 1605–1612 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sanchez-Garcia, R. et al. DeepEMhancer: eine Deep-Learning-Lösung für die Nachbearbeitung von Kryo-EM-Volumen. Komm. Biol. 4, 874 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Goddard, TD et al. UCSF ChimeraX: Bewältigung moderner Herausforderungen in der Visualisierung und Analyse. Proteinwissenschaft. 27, 14–25 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 60, 2126–2132 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Altschul, SF et al. Gapped BLAST und PSI-BLAST: Eine neue Generation von Proteindatenbank-Suchprogrammen. Nukleinsäuren Res. 25, 3389–3402 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGinnis, S. & Madden, TL BLAST: das Herzstück eines leistungsstarken und vielfältigen Satzes von Sequenzanalyse-Tools. Nukleinsäuren Res. 32, W20–W25 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cramer, P. AlphaFold2 und die Zukunft der Strukturbiologie. Nat. Struktur. Mol. Biol. 28, 704–705 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vagin, A. & Teplyakov, A. MOLREP: ein automatisiertes Programm für den molekularen Ersatz. J. Appl Crystallogr. 30, 1022–1025 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Die CCP4-Suite: Programme für die Proteinkristallographie. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 50, 760–763 (1994).

Lebedev, AA et al. JLigand: ein grafisches Tool für die CCP4-Template-Restraint-Bibliothek. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 68, 431–440 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murshudov, GN et al. REFMAC5 zur Verfeinerung makromolekularer Kristallstrukturen. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 67, 355–367 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kanehisa, M., Furumichi, M., Tanabe, M., Sato, Y. & Morishima, K. KEGG: Neue Perspektiven auf Genome, Signalwege, Krankheiten und Medikamente. Nukleinsäuren Res. 45, D353–D361 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Oberto, J. SyntTax: ein Webserver, der Syntenie mit der prokaryotischen Taxonomie verbindet. BMC Bioinf. 14, 4 (2013).

Artikel Google Scholar

Mirdita, M. et al. ColabFold: Proteinfaltung für alle zugänglich machen. Nat. Methoden 19, 679–682 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krissinel, E. & Henrick, K. Secondary-Structure Matching (SSM), ein neues Werkzeug zur schnellen Proteinstrukturausrichtung in drei Dimensionen. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 60, 2256–2268 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sievers, F. et al. Schnelle, skalierbare Generierung hochwertiger Protein-Mehrfachsequenz-Alignments mit Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, 539 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, L. et al. Das Genom von Sulfolobus acidocaldarius, einem Modellorganismus der Crenarchaeota. J. Bakteriol. 187, 4992–4999 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken Carsten Sachse vom Forschungszentrum Jülich für seine hilfreichen Vorschläge zur Spiralrekonstruktion. Wir danken Diamond für den Zugang und die Unterstützung der KryoEM-Einrichtungen im britischen National Electron Bio-Imaging Centre (eBIC), finanziert vom Wellcome Trust, MRC und BBSRC. Wir danken auch der EM-Einrichtung der Fakultät für Biologie der Universität Freiburg für den Zugang zu ihren Mikroskopen. Das TEM (Hitachi HT7800) wurde durch das DFG-Stipendium (Projektnummer 426849454) gefördert und wird von der Universität Freiburg, Fakultät für Biologie, als Partnereinheit innerhalb der Microscopy and Image Analysis Platform (MIAP) und des Life Imaging Center betrieben ( LIC), Freiburg. MG, MM und RUH wurden durch einen ERC Starting im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Fördervereinbarung Nr. 803894) unterstützt, der an BD vergeben wurde. AN wurde vom britischen Biotechnology and Biological Science Research Council (Fördervereinbarungsnummer BB/R008639/1) gefördert, die an VGSS vergeben wurde, und SVA wurde vom Sonderforschungsbereich SFB1381 gefördert, finanziert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) – Projekt -ID 403222702 – SFB 1381. SS und SVA wurden auch von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Deutschen Exzellenzstrategie gefördert (CIBSS–EXC-2189–Projekt-ID 390939984).

Living Systems Institute, University of Exeter, Stocker Road, EX4 4QD, Exeter, Großbritannien

Matthew C. Gaines, Risat Ul Haque, Mathew McLaren, Alexander Neuhaus, Vicki AM Gold und Bertram Daum

Abteilung für Biowissenschaften, Fakultät für Gesundheits- und Biowissenschaften, Stocker Road, EX4 4QD, Exeter, Großbritannien

Matthew C. Gaines, Risat Ul Haque, Mathew McLaren, Alexander Neuhaus, Vicki AM Gold und Bertram Daum

Henry Wellcome Building for Biocatalysis, Department of Biosciences, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, EX4 4QD, Exeter, Großbritannien

Michail N. Isupow

Institut für Biologie II, Molekularbiologie der Archaeen, Universität Freiburg, Schänzlestraße 1, 79104, Freiburg, Deutschland

Shamphavi Sivabalasarma, Clara L. Mollat, Patrick Tripp und Sonja-Verena Albers

Spemann Graduate School of Biology and Medicine, Universität Freiburg, Freiburg, Deutschland

Shamphavi Sivabalasarma & Sonja-Verena Albers

Signalforschungszentren BIOSS und CIBBS, Fakultät für Biologie, Universität Freiburg, Freiburg, Deutschland

Sonja-Verena Albers

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Wichtige Beiträge zu (i) dem Konzept oder Design der Studie (SA, BD) (ii) der Erfassung, Analyse oder Interpretation der Daten (MG, MI, SS, RH, MM, CM, PT, AN, BD) ; (iii) Verfassen des Manuskripts (MG, MI, SS, RH, VG, SA, BD) und Bereitstellung von Ressourcen (BD, VG, SA).

Korrespondenz mit Bertram Daum.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Nature Communications dankt Manuela Hospenthal und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Gaines, MC, Isupov, MN, Sivabalasarma, S. et al. Elektronenkryomikroskopie enthüllt die Struktur des archaischen Fadenfilaments. Nat Commun 13, 7411 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34652-4

Zitat herunterladen

Eingegangen: 27. April 2022

Angenommen: 02. November 2022

Veröffentlicht: 01. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34652-4

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.

Nachricht